[發(fā)明專利]一種尖孢鐮刀菌的篩選方法及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210342586.0
• 申請(qǐng)日: 2012-09-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102925362A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾西柏;蘇世鳴;蔣細(xì)良;白玲玉;李蓮芳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所
• 主分類號(hào): C12N1/14
• 分類號(hào): C12N1/14;C12N1/02;C12Q1/02;B09C1/10;C12R1/77
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• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及真菌的篩選方法及其應(yīng)用，尤其涉及尖孢鐮刀菌(Fusarium?oxysporum)的篩選方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

砷是一種在自然界廣泛存在的有毒并且致癌的非金屬元素，砷污染已成為全球危害十分嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題之一。據(jù)報(bào)道，全球至少5000多萬(wàn)人口正面臨著地方性砷中毒的威脅，其中大多數(shù)為亞洲國(guó)家，中國(guó)是受砷中毒危害最為嚴(yán)重的國(guó)家之一，在1956-1984年二十多年間，中國(guó)曾發(fā)生過(guò)30余起地砷中毒事件。我國(guó)是砷礦大國(guó)，砷礦廣泛分布在我國(guó)的中南和西南的湖南、云南、廣西、廣東等省區(qū)，砷礦開(kāi)采或冶煉，含砷農(nóng)藥、化肥等農(nóng)資產(chǎn)品的過(guò)量投入等，可造土壤砷的累積，進(jìn)而影響著植物、動(dòng)物的生長(zhǎng)和發(fā)育，且可以通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人類的生存和健康構(gòu)成威脅。

目前常用的砷污染土壤修復(fù)方法包括土壤改良劑法、溶土法、排土法、化學(xué)沖洗法以及生物修復(fù)技術(shù)。

生物修復(fù)技術(shù)是利用生物(主要是微生物、植物)作用來(lái)消減、凈化土壤中的砷或改變砷的形態(tài)，被普遍認(rèn)為是砷污染治理中最具應(yīng)用前景的技術(shù)。其中利用超積累植物去除土壤砷的植物修復(fù)技術(shù)在最近的幾年中取得了突破性的進(jìn)展，蜈蚣草(Brakefern，Pteris?vitta)和大葉井口邊草(Pteris?nervosa)等超積累砷的植物相繼被發(fā)現(xiàn)，并用于砷污染地區(qū)的土壤修復(fù)。在金屬污染土壤的生物修復(fù)技術(shù)中，除了應(yīng)用超積累植物吸收富集金屬外，利用植物、微生物將金屬轉(zhuǎn)化為沸點(diǎn)較低的有機(jī)化合物揮發(fā)到大氣中從而去除土壤中的金屬也逐漸引起了人們的重視。如Terry等利用微生物和植物的作用，將環(huán)境中的硒(Se)轉(zhuǎn)化為生物毒性較低的氣態(tài)形式(二甲基硒和二甲基二硒)，直接或通過(guò)植物的組織揮發(fā)到大氣中。Meagher等將細(xì)菌體內(nèi)的汞(Hg)還原酶基因轉(zhuǎn)入芥子科植物Arabidopsis后，得到的轉(zhuǎn)基因植物能耐受、吸收土壤環(huán)境中的Hg，并將Hg²⁺還原成Hg⁰后揮發(fā)進(jìn)入大氣。土壤中的砷化合物也可以轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài)的甲基砷等物質(zhì)，在多個(gè)圈層中遷移和轉(zhuǎn)化。因此，利用某些微生物的對(duì)砷的富集、利用和轉(zhuǎn)化、揮發(fā)等功能，將As累積到生物體內(nèi)或?qū)⑵湫纬梢讚]發(fā)態(tài)砷化合物，已成為潛在的土壤As污染修復(fù)技術(shù)之一。

目前國(guó)內(nèi)報(bào)道的對(duì)砷具有生物累積與揮發(fā)能力的真菌還沒(méi)有，國(guó)外報(bào)道也屈指可數(shù)，且大多還只是局限于理論上的研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種尖孢鐮刀菌的篩選方法，將尖孢鐮刀菌應(yīng)用于治理砷污染土壤以及降低砷在作物及農(nóng)產(chǎn)品中的累積。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種尖孢鐮刀菌的篩選方法，包括：

采集砷污染土壤樣品，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)從所述土壤樣品中分離出真菌，將所述真菌純化后轉(zhuǎn)接于尖孢鐮刀菌的選擇性培養(yǎng)基上；以該選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況最好的真菌菌株為對(duì)象，在固態(tài)PGP培養(yǎng)基上將該真菌菌株與浸有不同濃度砷的濾紙片作用，觀察該真菌在不同濃度砷脅迫下的菌落生長(zhǎng)狀況，由此篩選出尖孢鐮刀菌。

該尖孢鐮刀菌Fusarium?oxysporum已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址標(biāo)注在后)保存，保存編號(hào)為CGMCC?No.3185，保存日期為2009年7月09日。

優(yōu)選地，該方法具體包括：

將土壤樣品經(jīng)梯度稀釋后涂布于砷含量為400～600mg/L的馬丁培養(yǎng)基上分離出真菌；

將分離出的真菌經(jīng)反復(fù)純化后，分別挑取少量菌絲，接種于配好的尖孢鐮刀菌的選擇性培養(yǎng)基上，于24～26℃下培養(yǎng)5-7天后，以生長(zhǎng)狀況最好的真菌菌株作為接種目標(biāo)，取直徑為5～7mm的圓形菌塊或邊長(zhǎng)為5～7mm的方形菌塊放于PGP培養(yǎng)基上，在距菌塊為1～3cm處分別放置浸有不同濃度砷溶液的直徑為2～4mm的圓形濾紙片，砷濃度的范圍設(shè)置為1000～30000mg/L；將PGP培養(yǎng)基于24～26℃下培養(yǎng)5天后，通過(guò)觀察菌株的生長(zhǎng)情況篩選出尖孢鐮刀菌。

優(yōu)選地，

馬丁培養(yǎng)基的成分包括：葡萄糖、蛋白胨、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、瓊脂以及水，各成分的重量比為5∶10∶2∶1∶80∶4000；