[發明專利]一種尖孢鐮刀菌的篩選方法及其應用

無效

• 申請號: 201210342586.0
• 申請日: 2012-09-17
• 公開（公告）號: CN102925362A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 曾西柏;蘇世鳴;蔣細良;白玲玉;李蓮芳
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/02;C12Q1/02;B09C1/10;C12R1/77
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1.一種尖孢鐮刀菌的篩選方法，包括：

采集砷污染土壤樣品，在實驗室內從所述土壤樣品中分離出真菌，將所述真菌純化后轉接于尖孢鐮刀菌的選擇性培養基上；以該選擇性培養基上生長狀況最好的真菌菌株為對象，在固態PGP培養基上將所述真菌菌株與浸有不同濃度砷的濾紙片作用，觀察所述真菌在不同濃度砷脅迫下的菌落生長狀況，由此篩選出尖孢鐮刀菌。

2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，具體包括：

將所述土壤樣品經梯度稀釋后涂布于砷含量為400～600mg/L的馬丁培養基上分離出真菌；

將分離出的所述真菌經反復純化后，分別挑取少量菌絲，接種于配好的所述尖孢鐮刀菌的選擇性培養基上，于24～26℃下培養5-7天后，以生長狀況最好的真菌菌株作為接種目標，取直徑為5～7mm的圓形菌塊或邊長為5～7mm的方形菌塊放于所述PGP培養基上，在距所述菌塊為1～3cm處分別放置浸有不同濃度砷溶液的直徑為2～4mm的圓形濾紙片，所述砷濃度的范圍設置為1000～30000mg/L；將所述PGP培養基于24～26℃下培養5天后，通過觀察菌株的生長情況篩選出所述尖孢鐮刀菌。

3.按照權利要求2所述的方法，其特征在于，

所述馬丁培養基的成分包括：葡萄糖、蛋白胨、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、瓊脂以及水，各成分的重量比為5∶10∶2∶1∶80∶4000；

所述尖孢鐮刀菌的選擇性培養基的成分包括：四硼酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鉀、硫酸鎂、EDTA鐵納鹽、D-半乳糖、L-天門冬酰胺、瓊脂、75％的五氯硝基苯、牛膽鹽、硫酸鏈霉素以及蒸餾水，各個成分的重量百分比為：100∶100∶50∶50∶1∶2000∶200∶1500∶100∶50∶30∶100000；用10％鹽酸或10％的氫氧化鈉將所述培養基的pH值調整到3.8～4.0；

所述PGP培養基的成分包括：馬鈴薯、葡萄糖、蛋白胨以及水，各成分的重量比為40∶4∶1∶400。

4.一種尖孢鐮刀菌對砷的抗性的鑒定方法，包括：

在室內培養條件下測定尖孢鐮刀菌對砷的生物累積與揮發能力，以及在含有不同濃度砷的溶液的培養條件下尖孢鐮刀菌生物量的變化，由此鑒定所述尖孢鐮刀菌對砷的抗性。

5.按照權利要求4所述的方法，其特征在于，所述在室內培養條件下測定尖孢鐮刀菌對砷的生物累積與揮發能力，具體包括：

配制總砷含量為50mg/L的PGP培養基，在120～125℃下滅菌13～17分鐘后，接入0.1mL尖孢鐮刀菌生物量為10⁴cfu/mL的菌懸液，培養溫度為23～27℃，轉速為138～142rmp，振蕩培養5天后，以3800～4200rmp進行離心處理8～12分鐘，用超純水反復清洗菌質4次，洗掉殘留的培養基，將所述菌質于48～52℃下烘干至恒重，然后對所述菌質稱重，用11～13mL體積比為4～6∶1的HNO₃、HClO₄混合液在158～162℃條件下將所述菌質消煮10小時，采用原子熒光測定所述菌質中的總砷含量；將離心出的培養液及清洗所述菌質的超純水混合后作為上清液采用所述原子熒光測定總砷含量；

所述菌質中的總砷含量作為尖孢鐮刀菌對砷的生物累積量，尖孢鐮刀菌對砷的揮發量＝配置的總砷含量-所述菌質中的總砷含量-所述上清液中的總砷含量。

6.按照權利要求5所述的方法，其特征在于，

參照在所述總砷含量為50mg/L的PGP培養基中接入尖孢鐮刀菌的處理，分別以在所述總砷含量為50mg/L的PGP培養基中不接入尖孢鐮刀菌處理以及在PGP培養基中接入尖孢鐮刀菌而不配置砷含量的處理作為對照，對每項處理均重復多次。