[發(fā)明專利]一種可溶藻的賴氨酸芽孢桿菌原生質(zhì)體制備與再生方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210342222.2
• 申請(qǐng)日: 2012-09-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103013849A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張文藝;陳雪珍;李仁霞;李秋艷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 常州大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/20
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于環(huán)境工程微生物領(lǐng)域，具體涉及一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌原生質(zhì)體的制備與再生方法。?

背景技術(shù)

近年來(lái)，隨著水體富營(yíng)養(yǎng)化程度的加劇，夏秋季節(jié)藍(lán)藻大面積快速繁殖，藍(lán)藻水華頻繁暴發(fā)，大量的藍(lán)藻覆蓋在水體表面，嚴(yán)重阻礙了水體的流動(dòng)，水體自凈能力降低，復(fù)氧率減小，水體透明度下降，水質(zhì)惡臭，魚(yú)、蝦等浮游生物因生活環(huán)境發(fā)生惡化而死亡。目前控制藍(lán)藻最常用的依然是傳統(tǒng)的機(jī)械打撈，然而人力、物力有限，僅能打撈小部分的藍(lán)藻，大部分的藍(lán)藻在水體內(nèi)因腐爛而消失，而藍(lán)藻危害并沒(méi)有隨著其消失而減弱，腐爛的藍(lán)藻細(xì)胞破碎后就會(huì)向水體釋放各種藻類(lèi)毒素，其中屬于藍(lán)藻門(mén)的微囊藻在世界藍(lán)藻水華水體中占有相當(dāng)大的比例，我國(guó)的太湖流域就以微囊藻為主，它在繁殖的過(guò)程中產(chǎn)生大量的毒性較大的MCs，并儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)，隨著微囊藻的死亡及藻細(xì)胞的破碎，MCs被釋放到水體中，且以溶解性狀態(tài)存在，嚴(yán)重威脅流域附近居民的健康。在現(xiàn)有的物理、化學(xué)及生物等傳統(tǒng)方法達(dá)不到理想控制效果的情況下，利用溶藻細(xì)菌和MCs降解菌聯(lián)合處理藍(lán)藻，構(gòu)建兼具溶藻和MCs降解功能的雙效工程菌即成為一個(gè)新的研究方向。?

原生質(zhì)體融合重組可使兩親本菌株的優(yōu)良性狀同時(shí)表達(dá)出來(lái)，也可能使隱性基因因重組而暴露表達(dá)或隨機(jī)產(chǎn)生新的基因表達(dá)出新的性狀，從而成為微生物育種的一種途徑。應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建高效降解菌株用以處理污水的研究已經(jīng)有報(bào)道。《食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)》2005年第24卷第2期34-37頁(yè)報(bào)道了廖勁松等以單重抗藥性的突變菌株（S27和K215）為親本菌株，通過(guò)原生質(zhì)體融合獲得高效PVA降解菌F-4。《河南科學(xué)》2009年第27卷第7期809-812頁(yè)報(bào)道了張琪等利用原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得兼具兩個(gè)親本優(yōu)良性狀的紅霉素高產(chǎn)菌株，對(duì)提高紅霉素產(chǎn)量及化學(xué)藥價(jià)具有較大的應(yīng)用價(jià)值。?

微生物溶藻、降解MCs是一個(gè)很有效的方法，國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者已篩選出多種溶藻菌、MCs降解菌，溶藻菌在溶藻過(guò)程中，破壞藍(lán)藻細(xì)胞，釋放出胞內(nèi)MCs。利用原生質(zhì)體融合技術(shù)可能將兩株分別具有溶藻、MCs降解能力的細(xì)菌構(gòu)建成兼具兩個(gè)親本菌株優(yōu)良性狀的高效降解工程菌。目前，原生質(zhì)體融合技術(shù)在溶藻、MCs降解工程菌構(gòu)建上的應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。?

通過(guò)分離篩選獲得溶藻細(xì)菌F8，其對(duì)銅綠微囊藻FACHB-905均有較好的溶藻效果。可從以下兩個(gè)思路出發(fā)：一是制備溶藻細(xì)菌、MC降解菌復(fù)合菌劑；二是構(gòu)建兼具溶藻和MC降解功能的轉(zhuǎn)基因工程菌。本方法以原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建工程菌為基礎(chǔ)，主要研究實(shí)驗(yàn)室已分離的溶藻細(xì)菌（Lysinibacillus?fusiformis）的原生質(zhì)體制備，該菌是本實(shí)驗(yàn)室從太湖流域野生白鰱魚(yú)腸道中篩選出的1株溶解銅綠微囊藻的紡錘形賴氨酸芽孢桿菌，已申請(qǐng)發(fā)明專利，保藏號(hào)為CGMCC?NO.6106。鑒于親本菌株的抗性標(biāo)記工作量大，天然抗性難以確定，抗性突變亦可能使優(yōu)良性狀發(fā)生不定向改變，為確保親本菌株保持其各自的優(yōu)良生物學(xué)特性，本研究選用滅活原生質(zhì)體融合法，既減少了工作量，又保證了后續(xù)研究中融合子的質(zhì)量。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌原生質(zhì)體制備與再生的方法，使得其制備率與再生率都達(dá)到較高范圍。?

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌的原生質(zhì)體制備與再生方法，按照下述步驟進(jìn)行：

（1）菌種活化培養(yǎng)：

將保藏的菌株F8重新轉(zhuǎn)接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于溫度為30℃，轉(zhuǎn)速120?r/min的振蕩培養(yǎng)箱中純培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，約為10⁸-10⁹個(gè)/mL；

（2）原生質(zhì)體的破壁酶解：

取4?mL活化的菌液，4500?r/min離心10?min，收集菌體，經(jīng)SMM緩沖液洗滌3次，用3.2-3.8mL的SMM緩沖液重懸；加入0.1-1?mg/mL的溶菌酶0.2-0.8mL，在水浴溫度30℃條件下酶解0.17-1?h；酶解結(jié)束后，3000?r/min離心收集原生質(zhì)體，用0.55?mol/L的NaCl溶液洗滌3次，洗去酶解液后用4?mL?0.55?mol/L?NaCl溶液懸浮即可制備得到原生質(zhì)體；

（3）原生質(zhì)體的再生：??????

取上述步驟的原生質(zhì)體懸浮液，用高滲NaCl溶液稀釋到合適的三個(gè)梯度，分別吸取200?μl涂布于高滲固體培養(yǎng)基，每個(gè)梯度做三個(gè)平行，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48?h，使得原生質(zhì)體再生。