[發明專利]一種可溶藻的賴氨酸芽孢桿菌原生質體制備與再生方法

有效

• 申請號: 201210342222.2
• 申請日: 2012-09-17
• 公開（公告）號: CN103013849A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 張文藝;陳雪珍;李仁霞;李秋艷
• 申請（專利權）人: 常州大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

1.一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌的原生質體制備與再生方法，其特征在于按照下述步驟進行：

（1）菌種活化培養：

將保藏的菌株F8重新轉接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細菌液體培養基中，置于溫度為30℃，轉速120?r/min的振蕩培養箱中純培養至對數期，為10⁸-10⁹個/mL；

（2）原生質體的破壁酶解：

取4?mL活化的菌液，4500?r/min離心10?min，收集菌體，經SMM緩沖液洗滌3次，用3.2-3.8mL的SMM緩沖液重懸；加入0.1-1?mg/mL的溶菌酶0.2-0.8mL，在水浴溫度30℃條件下酶解0.17-1?h；酶解結束后，3000?r/min離心收集原生質體，用0.55?mol/L的NaCl溶液洗滌3次，洗去酶解液后用4?mL?0.55?mol/L?NaCl溶液懸浮即可制備得到原生質體；

（3）原生質體的再生：???????

取上述步驟的原生質體懸浮液，用高滲NaCl溶液稀釋到合適的三個梯度，分別吸取200?μl涂布于高滲固體培養基，每個梯度做三個平行，置于30℃恒溫培養箱培養48?h，使得原生質體再生。

2.根據權利要求1所述的一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌的原生質體制備與再生方法，其特征在于所述的溶藻細菌（Lysinibacillus?fusiformis），保藏號為CGMCC?NO.6106。

3.根據權利要求1所述的一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌的原生質體制備與再生方法，其特征在于步驟（1）中菌種活化培養用細菌培養基組成如下：牛肉膏3?g；蛋白胨10?g；NaCl?5?g；蒸餾水1000?mL；pH?7.0-7.2；若為固體培養基則添加瓊脂粉2.4%；上述培養基根據要求在高壓滅菌鍋中于121℃條件下滅菌20?min。

4.根據權利要求1所述的一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌的原生質體制備與再生方法，其特征在于步驟（3）中原生質體的再生用的高滲液體培養基組成如下：蛋白胨?10?g，酵母浸出汁?5?g，牛肉膏?5?g，蔗糖?170?g，蒸餾水定容至1000?mL，pH?7.2；若為高滲固體培養基則加入瓊脂粉20-24?g；上述培養基根據要求在高壓滅菌鍋中于121℃條件下滅菌20?min。

5.根據權利要求1所述的一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌的原生質體制備與再生方法，其特征在于所述的溶液配制如下：（1）高滲NaCl溶液：NaCl?0.55?mol/L；（2）SMM緩沖液：蔗糖?0.55?mol/L，順丁希二酸?20?mmol/L，MgCl₂·6H₂O?20?mmol/L，pH?6.8；（3）溶菌酶：0.?1-1?mg/mL，SMM緩沖液配制；上述溶液根據要求在高壓滅菌鍋中于121℃條件下滅菌20?min。