[發明專利]一種降解MC-LR的賴氨酸芽孢桿菌原生質體制備與再生的方法

有效

• 申請號: 201210342202.5
• 申請日: 2012-09-17
• 公開（公告）號: CN103013848A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 張文藝;陳雪珍;李仁霞;李秋艷
• 申請（專利權）人: 常州大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/07
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

技術領域

本發明涉及生物工程中原生質體制備與再生的方法技術領域，尤其是降解MC-LR的賴氨酸芽孢桿菌原生質體的制備與再生。?

背景技術

近年來，隨著水體富營養化程度的加劇，夏秋季節藍藻大面積快速繁殖，藍藻水華頻繁暴發，大量的藍藻覆蓋在水體表面，嚴重阻礙了水體的流動，水體的自凈能力降低，復氧率減小，透明度下降，水質惡臭，水體內的魚、蝦等浮游生物因生活環境發生惡化而死亡。目前控制藍藻最常用的依然是傳統的機械打撈，然而，畢竟人力、物力有限，僅能打撈小部分的藍藻，大部分的藍藻在水體內因腐爛而消失，而藍藻危害并沒有隨著其消失而減弱，腐爛的藍藻細胞破碎后就會向水體釋放各種藻類毒素，其中屬于藍藻門的微囊藻在世界藍藻水華水體中占有相當大的比例，我國的太湖流域就以微囊藻為主，它在繁殖的過程中產生大量的毒性較大的MCs，并儲存在細胞內，隨著微囊藻的死亡及藻細胞的破碎，MCs被釋放到水體中，且以溶解性狀態存在，嚴重威脅流域附近居民的健康。在現有的物理、化學及生物等傳統方法達不到理想控制效果的情況下，利用溶藻細菌和MCs降解菌聯合處理藍藻，構建兼具溶藻和MCs降解功能的雙效工程菌即成為一個新的研究方向。?

原生質體融合重組可使兩親本菌株的優良性狀同時表達出來，也可能使隱性基因因重組而暴露表達或隨機產生新的基因表達出新的性狀，從而成為微生物育種的一種途徑。應用原生質體融合技術構建高效降解菌株用以處理污水的研究已經有報道。《食品與生物技術學報》2005年第24卷第2期34-37頁報道了廖勁松等以單重抗藥性的突變菌株（S27和K215）為親本菌株，通過原生質體融合獲得高效PVA降解菌F-4。《河南科學》2009年第27卷第7期809-812頁報道了張琪等利用原生質體融合技術獲得兼具兩個親本優良性狀的紅霉素高產菌株，對提高紅霉素產量及化學藥價具有較大的應用價值。?

微生物溶藻、降解MCs是一個很有效的方法，國內外不少學者已篩選出多種溶藻菌、MCs降解菌，溶藻菌在溶藻過程中，破壞藍藻細胞，釋放出胞內MCs，而在正常藍藻細胞環境中單獨的MCs降解菌只能降解胞外MCs，這就要求溶藻細菌與MCs降解菌聯合使用，從而在溶藻的同時降解毒性較大的MCs，真正做到治標且治本。但是多種菌的優化組合來溶藻并降解MCs是一個很復雜的課題。利用原生質體融合技術可能將兩株分別具有溶藻、MCs降解能力的細菌構建成兼具兩個親本菌株優良性狀的高效降解工程菌。目前，原生質體融合技術在MCs降解工程菌構建上的應用，國內外鮮有報道。?

通過分離篩選分別獲得溶藻細菌F8、TL，其對銅綠微囊藻FACHB-905均有較好的溶藻效果。然而已發現的溶藻細菌在溶解藻細胞的同時使胞內藻毒素釋放到水體中，加劇了藍藻水華帶來的藻毒素污染，其中以MC的危害最為嚴重。為從根本上解決藍藻水華帶來的MC污染問題，即去除藍藻的同時降解MC，可從以下兩個思路出發：一是制備溶藻細菌、MC降解菌復合菌劑；二是構建兼具溶藻和MC降解功能的轉基因工程菌。本方法以原生質體融合技術構建工程菌為基礎，主要研究實驗室已分離的MC-LR高效降解菌T1（Bacillus?sphaericus）的原生質體制備，該菌是本實驗室從太湖河浜底泥中篩選出的1株降解MC-LR的球形芽孢桿菌，已申請發明專利，公開號為CN102154170，保藏號為CGMCC?NO.4498。鑒于親本菌株的抗性標記工作量大，天然抗性難以確定，抗性突變亦可能使優良性狀發生不定向改變，為確保親本菌株保持其各自的優良生物學特性，本研究選用滅活原生質體融合法，既減少了工作量，又保證了后續研究中融合子的質量。?

發明內容

本發明的目的是提供一種賴氨酸芽孢桿菌原生質體制備與再生的方法，使得其制備率與再生率都達到較高范圍。?

本發明所采用的技術方案如下：

一種降解MC-LR的賴氨酸芽孢桿菌的原生質體制備與再生方法，按照下述步驟進行：

（1）菌種活化培養：

將保藏的菌株T1?（Bacillus?sphaericus）重新轉接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細菌液體培養基中，置于溫度為30℃，轉速120?r/min的振蕩培養箱中純培養至對數期，約為10⁸-10⁹個/mL；

（2）原生質體的破壁酶解：?????