[發(fā)明專利]一種降解MC-LR的賴氨酸芽孢桿菌原生質(zhì)體制備與再生的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210342202.5
• 申請日: 2012-09-17
• 公開（公告）號: CN103013848A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張文藝;陳雪珍;李仁霞;李秋艷
• 申請（專利權(quán)）人: 常州大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/07
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

1.一種降解MC-LR的賴氨酸芽孢桿菌的原生質(zhì)體制備與再生方法，其特征在于按照下述步驟進行：

（1）菌種活化培養(yǎng)：

將保藏的菌株T1?（Bacillus?sphaericus）重新轉(zhuǎn)接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細菌液體培養(yǎng)基中，置于溫度為30℃，轉(zhuǎn)速120?r/min的振蕩培養(yǎng)箱中純培養(yǎng)至對數(shù)期，為10⁸-10⁹個/mL；

（2）原生質(zhì)體的破壁酶解：??????

取4?mL活化的菌液，4500?r/min離心10?min，收集菌體，經(jīng)SMM緩沖液洗滌3次，用1.2-1.8mL的SMM緩沖液重懸；加入0.1-1?mg/mL的溶菌酶0.2-0.8mL和2?mL加熱至酶解溫度的EDTA溶液，在水浴溫度35℃條件下酶解0.5-1.5?h；酶解結(jié)束后，3000?r/min離心收集原生質(zhì)體，用0.55?mol/L的NaCl溶液洗滌3次，洗去酶解液后用4?mL?0.55?mol/L?NaCl溶液懸浮即可制備得到原生質(zhì)體；

（3）原生質(zhì)體的再生：???????

取上述步驟的原生質(zhì)體懸浮液，用高滲NaCl溶液稀釋到合適的三個梯度，分別吸取200?μl涂布于高滲固體培養(yǎng)基，每個梯度做三個平行，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48?h，使得原生質(zhì)體再生。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種降解MC-LR的賴氨酸芽孢桿菌的原生質(zhì)體制備與再生方法，其特征在于其中所述的菌株T1（Bacillus?sphaericus），保藏號為CGMCC?NO.4498。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種降解MC-LR的賴氨酸芽孢桿菌的原生質(zhì)體制備與再生方法，其特征在于其中步驟（1）中所述的菌種活化培養(yǎng)用的培養(yǎng)基組成如下：（1）細菌培養(yǎng)基：牛肉膏3?g；蛋白胨10?g；NaCl?5?g；蒸餾水1000?mL；pH?7.0-7.2；若為固體培養(yǎng)基則添加瓊脂粉2.4%；上述培養(yǎng)基根據(jù)要求在高壓滅菌鍋中于121℃條件下滅菌20?min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種降解MC-LR的賴氨酸芽孢桿菌的原生質(zhì)體制備與再生方法，其特征在于其中步驟（3）中所述的原生質(zhì)體的再生用的高滲液體培養(yǎng)基組成如下：蛋白胨?10?g，酵母浸出汁?5?g，牛肉膏?5?g，蔗糖?170?g，蒸餾水定容至1000?mL，pH?7.2；若為高滲固體培養(yǎng)基則加入瓊脂粉20-24?g；上述培養(yǎng)基根據(jù)要求在高壓滅菌鍋中于121℃條件下滅菌20?min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種降解MC-LR的賴氨酸芽孢桿菌的原生質(zhì)體制備與再生方法，其特征在于其中所述的溶液配制如下：（1）高滲NaCl溶液：NaCl?0.55?mol/L;（2）SMM緩沖液：蔗糖?0.55?mol/L，順丁希二酸?20?mmol/L，MgCl₂·6H₂O?20?mmol/L，pH?6.8;（3）EDTA溶液：EDTA?0.8?g/L，SMM緩沖液配制;（4）溶菌酶：0.1-1?mg/mL，SMM緩沖液配制;上述溶液根據(jù)要求在高壓滅菌鍋中于121℃條件下滅菌20?min。