[發(fā)明專利]一種高效制備重組人堿性成纖維細胞生長因子的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210341883.3
• 申請日: 2012-09-17
• 公開（公告）號: CN103667329A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設計）人: 徐明波;賈東晨;王俊玲;王喜鶴;秦富景;陳獻華;吳彥卓
• 申請（專利權(quán)）人: 北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司;北京雙鷺生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12R1/19
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明屬于基因工程領域，具體地涉及到一種重組人堿性成纖維細胞生長因子(rh-bFGF)的制備方法，同時涉及提高rh-bFGF在大腸桿菌中表達量的方法。?

發(fā)明背景?

重組人堿性成纖維細胞生長因子(Recombinant?Human?Basic?Fibroblast?Growth?Factor，rh-bFGF)是成纖維細胞生長因子(bFGF)家族的一個重要成員，目前所確定的bFGF分子量有18kD、22kD、22.5kD、24kD和34kD五種形式(Florkiewicz?RZ，Sommer?A.Human?basic?fibroblast?growth?factor?gene?encodes?four?polypeptides，three?initiate?translation?from?non-AUGcodons.Proc?Natl?Acad?Sci?USA，1989Jun，86(11)：3978-3981；Arnaud?E，Touriol?C，Boutonnet?C，Gensac?MC，Vagner?S，Prats?H，Prats?AC.A?new?34-kilodalton?isoform?of?human?fibroblast?growth?factor?2is?cap?dependently?synthesized?by?using?a?non-AUG?start?codon?and?behaves?as?a?survival?factor.Mol?Cell?Biol，1999Jan，19(1)：505-514)，其中分子量為18kD的bFGF包含155個氨基酸，不含N-端原子定位信號，且為bFGF活性的主要形式(Patry?V，Bugler?B，Amalric?F，ProméJC，Prats?H.Purification?and?characterization?of?the?210-amino?acid?recombinant?basic?fibroblast?growth?factor?form(FGF-2).FEBS?Lett，1994Jul?25，349(1)：23-28)。?

從不同組織提取的bFGF肽鏈長短不一，分子量均少于18KD。如牛腦垂體bFGF是由146個氨基酸組成的單鏈非糖化多肽，分子量為16.4KD。這是由于不同的bFGF的分子量因其N末端不同而異，bFGF羧基末端較氨基末端穩(wěn)定，少于155個氨基酸的bFGF均為其氨基末端截取形式?，F(xiàn)已證實含155個氨基酸的bFGF其氨基末端截取少于25個氨基酸時并不影響其生物學活性。(Chen-xiao?Jia?et?al，Cloning?and?high?level?nonfusion?expression?of?recombinant?human?basic?fibroblast?growth?factor?in?Escherichia?coli.Acta?Pharmacol?Sin，2002sep；23(9)：782-786)。?

bFGF在生物進化上具有很強的保守性，如：人bFGF(h-bFGF)和牛bFGF氨基酸順序同源性達98.7％，鳥類和牛bFGF完全相同。?

rh-bFGF具有重要的臨床應用價值，是基因工程重組蛋白質(zhì)類藥物，是治療人體燒傷、組織創(chuàng)傷、手術傷及難治性潰瘍(如褥瘡、糖尿病導致的膚體潰瘍伴有末梢神經(jīng)炎等)等疾病的首選藥物，是藥效明確、市場認可度高的品種之一。同時rh-bFGF在治療腦中風后遺癥、腦呆、退行性神經(jīng)病變、缺血性心臟病和外周血管病等方面有多項進入臨床試驗(牟旭鵬，?人堿性成纖維細胞生長因子cDNA的克隆及在畢赤酵母中的表達，吉林大學，2006，5；CHEN?Qiong-yu?et?al.，High?and?stable?expression?of?an?analog?of?human?basic?fibroblast?growth?factor?in?Escherichia?coli.Chinese?Journal?of?Pathophysiology?2006，22(2)：247-250)。?

bFGF來源于神經(jīng)組織、垂體、腎上腺皮質(zhì)、視網(wǎng)膜、黃體和胎盤等，但由于其含量極少，因此難以從純天然的組織中獲得。通過基因工程的手段在大腸桿菌中發(fā)酵不失為一種理想和常用的方法。?