[發(fā)明專(zhuān)利]焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)PPARγ基因多態(tài)性的試劑盒及方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210339004.3
• 申請(qǐng)日: 2012-09-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102876787A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周宏灝
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 周宏灝
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 長(zhǎng)沙正奇專(zhuān)利事務(wù)所有限責(zé)任公司 43113
• 代理人: 盧宏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的是涉及焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)PPARγ基因多態(tài)性的試劑盒及方法。

背景技術(shù)

噻唑烷二酮類(lèi)藥物是一類(lèi)新型的胰島素增敏劑，首個(gè)發(fā)現(xiàn)的藥物為環(huán)格列酮，而最早進(jìn)行臨床開(kāi)發(fā)研究的為曲格列酮，隨后羅格列酮、吡格列酮也先后問(wèn)世。該類(lèi)藥物自1997年進(jìn)入臨床以來(lái)，由于它具有改善胰島素抵抗及其相關(guān)的一系列病理生理變化的作用，因而近年來(lái)在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用和重視。

過(guò)氧化物酶增殖體激活受體(PPARγ)是一種由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于II型核受體超家族成員，是調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化的重要因子，而且是噻唑烷二酮類(lèi)藥物作用的靶分子。活化的PPARγ可以減少胰島素抵抗分子的產(chǎn)生，其對(duì)糖代謝相關(guān)的靶基因表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。

PPARγ基因突變?nèi)巳捍龠M(jìn)脂肪細(xì)胞的分化，減少胰島素抵抗分子的產(chǎn)生，增加噻唑烷二酮類(lèi)藥物的敏感性，從而增強(qiáng)降糖作用。PPARγ第六外顯子C/T突變與二型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)攜帶有T等位基因的人群，對(duì)藥物的敏感性增加，從而更好的發(fā)揮降糖作用，使患二型糖尿病的發(fā)病幾率降低。有研究表明在應(yīng)用羅格列酮治療中，由于PPARγ基因多態(tài)性的影響，Pro12Ala基因型攜帶者較Pro12Pro基因型的病人有更好的治療效應(yīng)，相比較而言在應(yīng)用相同藥物后Pro12Ala基因型患者治療有效性為Pro12Pro基因型患者的8.4倍左右。

PPARγ是影響噻唑烷二酮類(lèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征和毒副反應(yīng)的關(guān)鍵因素之一，開(kāi)發(fā)快速、高效、準(zhǔn)確、便捷、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)PPARΓ基因多態(tài)性的試劑盒將為噻唑烷二酮類(lèi)等藥物的臨床個(gè)體化治療起到積極的推動(dòng)作用。

焦磷酸測(cè)序(Pyro?sequencing)技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù)，該技術(shù)無(wú)須進(jìn)行電泳，DNA片段也無(wú)須熒光標(biāo)記，是一種通用型技術(shù)平臺(tái)。該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低、所需樣品量小、快捷、準(zhǔn)確、高通量等特點(diǎn)，符合臨床大樣本檢測(cè)要求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)PPARγ基因（SEQ?ID?NO.1）多態(tài)性的試劑盒及方法，以實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)其底物(如噻唑烷二酮類(lèi)降糖藥物等)個(gè)體化用藥相關(guān)基因SNP。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)PPARγ基因多態(tài)性的試劑盒，包括如下引物：

（1）擴(kuò)增引物：

上游引物：5′-AAACCCCTATTCCATGCTGTTA-3′（SEQ?ID?NO.2）；

下游引物：5′-TTACATAAATGCCCCCACGTC-3′；（SEQ?ID?NO.3）；

其中，下游引物的5′進(jìn)行生物素標(biāo)記；

（2）測(cè)序引物：5′-AAGGAATCGCTTTCTG-3′（SEQ?ID?NO.4）；

試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測(cè)序的常規(guī)試劑。

一種應(yīng)用上述試劑盒檢測(cè)PPARγ基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟：

（1）DNA提取；

（2）聚合酶鏈反應(yīng)：

配制50μl?PCR擴(kuò)增體系，包含：10×PCR?buffer?5.0μl，dNTP?1.5μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，rTaq0.5μl，水41.0μl，模板1.0μl；循環(huán)程序?yàn)椋?5°C?5min預(yù)變性；依次在95°C?30S，50°C?30S，72°C?30S，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72°C保持5min，最終保持在4°C，得擴(kuò)增產(chǎn)物；

（3）焦磷酸測(cè)序單鏈樣本純化；

（4）焦磷酸測(cè)序及結(jié)果分析。

本發(fā)明的試劑盒對(duì)PPARγRS1801282(C>G)目標(biāo)序列進(jìn)行分析和檢測(cè)，該目標(biāo)序列包括：野生型AGATTCTCCTATTGACCCAGAAAGCGATTCCTTCACT（SEQ????ID????NO.5）和突變型AGATTCTCCTATTGACGCAGAAAGCGATTCCTTCACT（SEQ?ID?NO.6）。

由于設(shè)計(jì)了特異性高的引物，并且選擇了合適的方法，本發(fā)明的試劑盒適用于對(duì)PPARγ基因多態(tài)性進(jìn)行快速檢測(cè)，可廣泛應(yīng)用于臨床上噻唑烷二酮類(lèi)個(gè)體化用藥方案制定的基因檢測(cè)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，其應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行短DNA序列分析，便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作流程；具有高通量、低成本等特點(diǎn)；PCR產(chǎn)物即可直接用于測(cè)序，不需進(jìn)行產(chǎn)物純化等二次處理，操作極為簡(jiǎn)便，所需樣品量小。

附圖說(shuō)明