[發明專利]一種肝吸蟲抗體IgG4生物素-親和素酶聯免疫檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 201210338184.3
• 申請日: 2012-09-13
• 公開（公告）號: CN102830231A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 余傳信;王玠;沈雙;宋麗君;殷旭仁;許永良
• 申請（專利權）人: 江蘇省血吸蟲病防治研究所
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/558;G01N21/31
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一種肝吸蟲抗原特異性抗體IgG4檢測試劑盒，其特征在于由包被有肝吸蟲成蟲抗原的酶標條（1），酶標條（1）為96孔微孔板，濃度為1μg/孔；

生物素標記的抗人IgG4特異性單克隆抗體（2），100μL×1瓶，工作濃度為1︰5000稀釋；

辣根過氧化物酶標記的鏈親和素（3），100μL×1瓶，工作濃度為1︰5000稀釋；

顯色液A（4），5mL×1瓶，市售品；

顯色液B（5），5mL×1瓶，市售品；

肝吸蟲抗體IgG4陽性對照品（6），100μL×1瓶，抗肝吸蟲的抗體IgG，濃度為1μg/mL；

肝吸蟲抗體IgG4陰性對照品（7），100μL×1瓶，純化的健康人IgG，濃度為1μg/mL；

樣品稀釋液（8），12mL×1瓶，含2%BSA的PBST；

抗體稀釋液（9），25mL×1瓶，含2%BSA的PBST；

濃縮洗滌液（10），50mL×1瓶，工作濃度為1︰20稀釋；

反應終止液（11），6mL×1瓶，2M?H₂SO₄；

和外包裝盒與說明書（12）組成；

所述肝吸蟲成蟲抗原的制備：將肝吸蟲蟲體用生理鹽水反復洗滌數次，洗盡肝吸蟲蟲體表面的附著物，直到洗滌液完全變澄清；用玻璃勻漿器在冰上將洗滌后肝吸蟲蟲體勻漿，加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟PMSF至終濃度為1mM，置于-80℃冰箱，反復凍融后超聲破碎后，4℃條件下高速離心，上清液即為肝吸蟲成蟲可溶性抗原，分裝后于-?80℃保存備用；

包被有肝吸蟲成蟲抗原的酶標條（1）的制備：用pH9.6碳酸緩沖包被液將肝吸蟲成蟲抗原稀釋成0.5-10μg/mL的溶液，按每孔100μL的量包被酶標條，4℃放置過夜后，將酶標條孔的包被液倒出，用稀釋洗滌液洗板三次，再用牛血清白蛋白封閉液進行封閉2h，倒去封閉液后用稀釋洗滌液洗板三次，真空抽干，4℃儲存備用；

生物素標記的抗人IgG4特異性單克隆抗體（2）的制備：

（a）將分泌抗人IgG4單克隆雜交瘤細胞注射到小鼠體內，產生腹水；

（b）收集腹水，采用Protean?A親和層析法純化抗人IgG4特異性單克隆抗體；

（c）將單克隆抗體與活化的生物素混合進行標記，透析去除未結合的生物素，得到生物素標記的抗人IgG4特異性單克隆抗體；

辣根過氧化物酶標記的鏈親和素（3）的制備：

（d）辣根過氧化物酶HRP在過碘酸鈉NaIO₄作用下，使HRP分子上的糖基氧化成醛基，透析去除化學試劑；

（e）加鏈親和素Streptavidin，HRP醛基與鏈親和素的氨基共價結合，形成Streptavidin-HRP結合物；

顯色液A（4）為市售品；

顯色液B（5）為市售品；?

肝吸蟲抗體IgG4陽性對照品（6），由純化的糞檢蟲卵陽性的肝吸蟲病人抗體IgG配制而成，用本試劑盒進行檢測其OD450nm吸光值大于0.5；

肝吸蟲抗體IgG4陰性對照品（7）：由純化的糞檢確定為非肝吸蟲感染的健康人群抗體IgG配制而成，使用本試劑盒進行檢測其OD450nm吸光值小于0.1；

樣品稀釋液（8）為含有牛血清白蛋白、Tween-20的磷酸緩沖液；

抗體稀釋液（9）為含有牛血清白蛋白、Tween-20的磷酸緩沖液；

濃縮洗滌液（10）為含Tween-20的磷酸緩沖液；

反應終止液（11）為硫酸。

2.用權利要求1所述肝吸蟲抗原特異性抗體IgG4檢測試劑盒檢測肝吸蟲抗體IgG4的方法，其特征在于步驟為：

（1）試劑盒在室溫平衡30min，濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水進行20倍稀釋，得稀釋洗滌液；

（2）取所需要使用的孔數的酶標條，包括樣本檢測孔，陽性對照孔，陰性對照孔，空白孔，每次檢測設陽性對照孔一個，陰性對照孔一個，空白孔二個，剩余的酶標條放入密封袋中保存；

（3）將酶標條固定于板架上，檢測孔加入100μL樣品稀釋液，再加入1μL待檢測樣品血清或直接加入1︰100稀釋的血清樣本，對照孔分別直接加入相應的對照樣本，在37℃溫箱溫育45min；

（4）甩盡孔中液體，加入稀釋洗滌液到滿孔350μL，震蕩30s后室溫靜置30s，甩干后，再加入稀釋洗滌液洗滌，如此重復5次；

（5）各孔加入100μL用抗體稀釋液按1:5000稀釋的生物素標記的抗人IgG4單克隆抗體，在37℃溫箱溫育45min；

（6）用稀釋洗滌液洗板5次后，加入100μL用抗體稀釋液按1:5000稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈親和素，在37℃溫箱溫育45min；

（7）用稀釋洗滌液洗板5次后，吸干各孔殘留液體，將顯色液A、B液等體積混勻后，各孔均加入A、B混合顯色液50μL，室溫避光顯色5?min，各孔加入終止液50μL，輕微振蕩混勻；

（8）結果判斷：以空白對照孔調零，用酶標儀測定各孔450nm的吸光值，

判讀前所有對照與樣本孔的A450nm值均應減去空白對照孔的A450nm值；

陽性：樣本孔的A450nm值≥陰性對照孔A450nm值的2.1倍，肝吸蟲抗體IgG4陽性；

陰性：樣本孔的A450nm值≤陰性對照孔A450nm值的2.1倍，肝吸蟲抗體IgG4陰性。