[發(fā)明專(zhuān)利]一種肝吸蟲(chóng)抗體IgG4生物素-親和素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210338184.3
• 申請(qǐng)日: 2012-09-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102830231A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-12-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 余傳信;王玠;沈雙;宋麗君;殷旭仁;許永良
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江蘇省血吸蟲(chóng)病防治研究所
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/577
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/577;G01N33/558;G01N21/31
• 代理公司: 無(wú)錫市大為專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所 32104
• 代理人: 時(shí)旭丹;劉品超

1.一種肝吸蟲(chóng)抗原特異性抗體IgG4檢測(cè)試劑盒，其特征在于由包被有肝吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原的酶標(biāo)條（1），酶標(biāo)條（1）為96孔微孔板，濃度為1μg/孔；

生物素標(biāo)記的抗人IgG4特異性單克隆抗體（2），100μL×1瓶，工作濃度為1︰5000稀釋?zhuān)?/p>

辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素（3），100μL×1瓶，工作濃度為1︰5000稀釋?zhuān)?/p>

顯色液A（4），5mL×1瓶，市售品；

顯色液B（5），5mL×1瓶，市售品；

肝吸蟲(chóng)抗體IgG4陽(yáng)性對(duì)照品（6），100μL×1瓶，抗肝吸蟲(chóng)的抗體IgG，濃度為1μg/mL；

肝吸蟲(chóng)抗體IgG4陰性對(duì)照品（7），100μL×1瓶，純化的健康人IgG，濃度為1μg/mL；

樣品稀釋液（8），12mL×1瓶，含2%BSA的PBST；

抗體稀釋液（9），25mL×1瓶，含2%BSA的PBST；

濃縮洗滌液（10），50mL×1瓶，工作濃度為1︰20稀釋?zhuān)?/p>

反應(yīng)終止液（11），6mL×1瓶，2M?H₂SO₄；

和外包裝盒與說(shuō)明書(shū)（12）組成；

所述肝吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原的制備：將肝吸蟲(chóng)蟲(chóng)體用生理鹽水反復(fù)洗滌數(shù)次，洗盡肝吸蟲(chóng)蟲(chóng)體表面的附著物，直到洗滌液完全變澄清；用玻璃勻漿器在冰上將洗滌后肝吸蟲(chóng)蟲(chóng)體勻漿，加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟PMSF至終濃度為1mM，置于-80℃冰箱，反復(fù)凍融后超聲破碎后，4℃條件下高速離心，上清液即為肝吸蟲(chóng)成蟲(chóng)可溶性抗原，分裝后于-?80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

包被有肝吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原的酶標(biāo)條（1）的制備：用pH9.6碳酸緩沖包被液將肝吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原稀釋成0.5-10μg/mL的溶液，按每孔100μL的量包被酶標(biāo)條，4℃放置過(guò)夜后，將酶標(biāo)條孔的包被液倒出，用稀釋洗滌液洗板三次，再用牛血清白蛋白封閉液進(jìn)行封閉2h，倒去封閉液后用稀釋洗滌液洗板三次，真空抽干，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/p>

生物素標(biāo)記的抗人IgG4特異性單克隆抗體（2）的制備：

（a）將分泌抗人IgG4單克隆雜交瘤細(xì)胞注射到小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生腹水；

（b）收集腹水，采用Protean?A親和層析法純化抗人IgG4特異性單克隆抗體；

（c）將單克隆抗體與活化的生物素混合進(jìn)行標(biāo)記，透析去除未結(jié)合的生物素，得到生物素標(biāo)記的抗人IgG4特異性單克隆抗體；

辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素（3）的制備：

（d）辣根過(guò)氧化物酶HRP在過(guò)碘酸鈉NaIO₄作用下，使HRP分子上的糖基氧化成醛基，透析去除化學(xué)試劑；

（e）加鏈親和素Streptavidin，HRP醛基與鏈親和素的氨基共價(jià)結(jié)合，形成Streptavidin-HRP結(jié)合物；

顯色液A（4）為市售品；

顯色液B（5）為市售品；?

肝吸蟲(chóng)抗體IgG4陽(yáng)性對(duì)照品（6），由純化的糞檢蟲(chóng)卵陽(yáng)性的肝吸蟲(chóng)病人抗體IgG配制而成，用本試劑盒進(jìn)行檢測(cè)其OD450nm吸光值大于0.5；

肝吸蟲(chóng)抗體IgG4陰性對(duì)照品（7）：由純化的糞檢確定為非肝吸蟲(chóng)感染的健康人群抗體IgG配制而成，使用本試劑盒進(jìn)行檢測(cè)其OD450nm吸光值小于0.1；

樣品稀釋液（8）為含有牛血清白蛋白、Tween-20的磷酸緩沖液；

抗體稀釋液（9）為含有牛血清白蛋白、Tween-20的磷酸緩沖液；

濃縮洗滌液（10）為含Tween-20的磷酸緩沖液；

反應(yīng)終止液（11）為硫酸。

2.用權(quán)利要求1所述肝吸蟲(chóng)抗原特異性抗體IgG4檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肝吸蟲(chóng)抗體IgG4的方法，其特征在于步驟為：

（1）試劑盒在室溫平衡30min，濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水進(jìn)行20倍稀釋?zhuān)孟♂屜礈煲海?/p>

（2）取所需要使用的孔數(shù)的酶標(biāo)條，包括樣本檢測(cè)孔，陽(yáng)性對(duì)照孔，陰性對(duì)照孔，空白孔，每次檢測(cè)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照孔一個(gè)，陰性對(duì)照孔一個(gè)，空白孔二個(gè)，剩余的酶標(biāo)條放入密封袋中保存；

（3）將酶標(biāo)條固定于板架上，檢測(cè)孔加入100μL樣品稀釋液，再加入1μL待檢測(cè)樣品血清或直接加入1︰100稀釋的血清樣本，對(duì)照孔分別直接加入相應(yīng)的對(duì)照樣本，在37℃溫箱溫育45min；

（4）甩盡孔中液體，加入稀釋洗滌液到滿孔350μL，震蕩30s后室溫靜置30s，甩干后，再加入稀釋洗滌液洗滌，如此重復(fù)5次；

（5）各孔加入100μL用抗體稀釋液按1:5000稀釋的生物素標(biāo)記的抗人IgG4單克隆抗體，在37℃溫箱溫育45min；

（6）用稀釋洗滌液洗板5次后，加入100μL用抗體稀釋液按1:5000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素，在37℃溫箱溫育45min；

（7）用稀釋洗滌液洗板5次后，吸干各孔殘留液體，將顯色液A、B液等體積混勻后，各孔均加入A、B混合顯色液50μL，室溫避光顯色5?min，各孔加入終止液50μL，輕微振蕩混勻；

（8）結(jié)果判斷：以空白對(duì)照孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450nm的吸光值，

判讀前所有對(duì)照與樣本孔的A450nm值均應(yīng)減去空白對(duì)照孔的A450nm值；

陽(yáng)性：樣本孔的A450nm值≥陰性對(duì)照孔A450nm值的2.1倍，肝吸蟲(chóng)抗體IgG4陽(yáng)性；

陰性：樣本孔的A450nm值≤陰性對(duì)照孔A450nm值的2.1倍，肝吸蟲(chóng)抗體IgG4陰性。