[發明專利]一種兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法

有效

• 申請號: 201210336241.4
• 申請日: 2012-09-12
• 公開（公告）號: CN103667404A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 余龍江;白云;周蓬蓬
• 申請（專利權）人: 華中科技大學
• 主分類號: C12P19/62
• 分類號: C12P19/62;C12R1/01
• 代理公司: 華中科技大學專利中心 42201
• 代理人: 曹葆青

技術領域

本發明涉及發酵工程和生物制藥領域，尤其是溶氧控制技術在發酵過程優化中的應用，具體為一種兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法。

背景技術

多殺菌素(spinosad)，又名多殺霉素或剌糖菌素，是由土壤放線菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora?spinosa)經有氧發酵后產生的胞內次級代謝產物，其主要活性成分是多殺菌素組分A(spinosyn?A)組分D(spinosyn?D)。多殺菌素是天然生成的抗生素，對鱗翅目及雙翅目等害蟲均有良好的防治效果，多殺菌素對昆蟲存在快速觸殺和攝食毒性，通過刺激昆蟲神經系統，導致非功能性的肌肉收縮、衰竭，并伴隨顫抖和麻痹。與一般殺蟲劑相比，多殺菌素兼具生物農藥的安全性和化學合成農藥的快速性效果，具有低毒、低殘留、對昆蟲天敵安全、自然分解快等諸多優點。在日益重視環保和安全的今天，多殺菌素作為高效無污染的綠色殺蟲劑受到越來越多的關注。

刺糖多孢菌是一種好氧型革蘭氏陽性放線菌。溶氧是影響多殺菌素發酵的重要因素之一，羅玉雙等將透明顫菌血紅蛋白基因轉入刺糖多孢菌中，以解決高密度深層培養過程中的供氧不足問題，提高了多殺菌素的產量(羅玉雙，中國科學，2012：2：148-157)，證明了溶氧對多殺菌素的生產有著重要的意義。刺糖多孢菌發酵動力學屬于生長部分相關型，即菌體生長一段時間后出現多殺菌素大量合成，多殺菌素產量與菌體量積累呈正相關，發酵過程中若溶氧太低將會使糖代謝緩慢，菌體生長不良，產物合成就會受到影響；而溶氧太高則會使菌體生長過于旺盛，底物完全氧化的比例過高，也不利于多殺菌素的合成。有報道，刺糖多孢菌在發酵過程中需將溶氧控制在50％或50％以上(拉維恩.德韋恩.博克招衡等，中國專利文獻CN1035391C)，雖然給出了溶氧控制的初步結果，但并沒有針對菌體生長和產物合成的需氧量分別進行深入研究。目前，尚未見針對刺糖多孢菌發酵過程中溶氧分階段控制的研究報道。

發明內容

基于以上問題，本發明的目的是提供一種兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法，該方法可以提高多殺菌素產量，縮短發酵周期。

本發明提供的一種兩階段溶氧控制提高多殺菌素產量的方法，在刺糖多孢菌發酵液制備階段，當刺糖多孢菌發酵一開始時，調控初始氧體積傳質系數k_La至100-130/小時(h^-1)，促進刺糖多孢菌生物量積累；當發酵進入到菌體生長對數生長末期時，再調控初始氧體積傳質系數k_La至60-92h^-1，促進多殺菌素合成與積累。

作為上述技術方案的一個改進，所述調控是指調節通氣量和攪拌轉速。

作為上述技術方案的另一個改進，在刺糖多孢菌發酵液制備階段之前，該方法還依次包括以下階段：刺糖多孢菌的孢子制備階段；刺糖多孢菌的一級種子液制備階段；以及刺糖多孢菌的二級種子液制備階段。

作為上述技術方案的進一步改進，所述刺糖多孢菌的孢子制備階段具體包括下述過程：將刺糖多孢菌凍干管中的凍干粉轉接進入斜面培養基中，活化后經過NTG(N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)化學誘變、紫外線物理誘變和原生質體融合，得到改良菌株；所述斜面培養基中含有葡萄糖：10.0-15.0；酪蛋白：2.0-3.0；酵母粉：1.0-2.0；瓊脂；15.0-20.0，單位：克/升。

作為上述技術方案的再進一步改進，所述刺糖多孢菌的一級種子液制備階段具體包括下述過程：將所述刺糖多孢菌的孢子制備階段制得的活化后刺糖多孢菌孢子接入刺糖多孢菌的一級種子培養基中，培養制得刺糖多孢菌一級種子液；所述每升一級種子培養基含有葡萄糖：10.0-15.0；酵母粉：2.0-2.5；酪蛋白：2.0-2.5；K₂HPO₄：0.2-0.4；MgSO₄：0.3-0.4，單位：克/升。

作為上述技術方案的又一更進一步改進，所述刺糖多孢菌的二級種子液制備階段具體包括下述過程：將所述刺糖多孢菌的一級種子液制備階段制得的一級種子液以10％(v/v)接種量接入二級種子培養基中，培養制得刺糖多孢菌的二級種子液；所述每升二級種子液培養基中含有葡萄糖：10.0-15.0；酵母粉：2.0-2.5；大豆蛋白胨：8.0-10.0；K₂HPO₄：0.2-0.4；MgSO₄：0.3-0.4，單位：克/升。