[發明專利]用于制備抗鰻利斯頓氏菌的卵黃抗體的滅活疫苗制法

有效

• 申請號: 201210335928.6
• 申請日: 2012-09-12
• 公開（公告）號: CN102836431A
• 公開（公告）日: 2012-12-26
• 發明（設計）人: 張曉君;畢可然;陳麗;閆斌倫;秦國民
• 申請（專利權）人: 淮海工學院
• 主分類號: A61K39/395
• 分類號: A61K39/395;A61P31/04
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 劉喜蓮

技術領域

本發明涉及一種滅活疫苗的制備方法，特別是涉及一種用于制備抗鰻利斯頓氏菌的卵黃抗體的滅活疫苗制法。?

背景技術

鰻利斯頓氏菌作為水產養殖動物的病原菌早已被確認，該菌最早由意大利的Canestrini于1893年首次從發生“紅疫”的鰻鱺中分離到。現已知其能引起硬頭鱒、大麻哈魚、大菱鲆、香魚、鰻魚、太平洋鮭、鰤魚、竹筴魚、真鯛、鱸魚、鰈魚、鱈魚、鮐魚、各種熱帶淡水魚以及蝦、蟹、牡蠣、文蛤、鮑等多種水產養殖動物發生致死性的弧菌病。由鰻利斯頓氏菌引起的疾病給水產動物養殖生產造成了很大的損失，因此，對鰻利斯頓氏菌引起的疾病的有效預防，以最大限度地降低其危害程度，將能顯著地提高水產動物養殖生產的經濟效益。?

目前養殖戶大多使用化學合成藥物或抗生素類藥物控制水產養殖動物弧菌病的發生與流行，市場上缺乏一種適用于水產養殖動物苗期幼體的使用方便的抗鰻利斯頓氏菌的免疫制劑。因此，開發研制抗鰻利斯頓氏菌的疫苗，對于有效控制水產養殖動物鰻利斯頓氏菌病的發生與流行具有重要的應用前景。?

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種提高水產養殖動物免疫力、降低海水魚養殖生產中由病原鰻利斯頓氏菌所造成的危害、以滿足水產動物養殖生產上的抗病需求的用于制備抗鰻利斯頓氏菌的卵黃抗體的滅活疫苗制法。?

本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種用于制備抗鰻利斯頓氏菌的卵黃抗體的滅活疫苗制法，其特點是：該方法以病原鰻利斯頓氏菌BH1（Listonella?anguillarum?BH1）經甲醛溶液滅活后作為免疫原，以白油、司班80和硬脂酸鋁作油乳劑，以黃芪浸出液作為免疫增強劑，乳化制備成油乳劑滅活疫苗；其具體步驟如下：?

（1）將病原鰻利斯頓氏菌BH1菌株接種在普通營養瓊脂肉湯培養基上，28-30℃搖床培養24h，加入體積終濃度0.3%的甲醛28℃滅活48h，離心得滅活菌體；

（2）取黃芪用蒸餾水浸泡30-60min后煎煮，過濾，濃縮至終濃度為原藥1g/mL，得黃芪浸出液；

（3）將白油加熱至50-55℃，加入硬脂酸鋁，硬脂酸鋁與白油的重量體積比為1-3：100?g?/?ml，繼續加熱至65-70℃，加入司班80，司班80與白油的體積比為5-7：100，直至終溫度115-120℃，維持15-20?min，制得油相，冷卻備用；

（4）將滅活菌體與黃芪浸出液混合，制得疫苗水相；水相中病原鰻利斯頓氏菌BH1免疫原為10¹¹cells/mL，黃芪浸出液為1g/mL，水相中還加入了終體積濃度為4%的吐溫80；

（5）將油相和水相按體積比2:1混合乳化研磨5min，制得黃芪和白油為聯合佐劑的鰻利斯頓氏菌油乳劑滅活疫苗。

本發明所述的病原鰻利斯頓氏菌（Listonella?anguillarum?BH1）已經在公開文獻《半滑舌鰨病原鰻利斯頓氏菌表型及分子特征研究》中所公開（菌株BH1），上述公開文獻發表于《海洋學報》，2009，31（5）：112-121。菌株BH1的DNA序列長度及Genebank登錄號見下表：?

該菌株BH1為公知公用材料，現保存在淮海工學院海洋學院實驗室，在本專利申請日起二十年內，公眾如果需要，淮海工學院海洋學院實驗室可對外發放。

本發明方法制得的鰻利斯頓氏菌油乳劑滅活疫苗的使用方法是：采用頸部皮下注射免疫的方法免疫成年產蛋雞，第1次免疫劑量為0.5?mL，一周后按前述方法加強免疫，免疫劑量為0.5?mL，一周后按前述方法繼續加強免疫，免疫劑量為1?mL，一周后按前述方法再加強免疫，免疫劑量為0.5?mL，共免疫4次，收集被免疫雞所產雞蛋，分離出卵黃，并測定其抗體效價。免疫結束后第1周至第2周卵黃抗體效價維持在2¹³左右，第3周以后卵黃抗體效價為2¹⁴左右。然后將所獲得的高免雞蛋作為原料，經冷凍干燥（蛋黃液厚度6mm，凍干時間10h）制備成含有抗鰻利斯頓氏菌的高免卵黃抗體的蛋黃粉，按5%左右比例添加在配合飼料中投喂使用。?