[發明專利]Caveolin-1基因突變的快速檢測方法

有效

• 申請號: 201210335560.3
• 申請日: 2012-09-11
• 公開（公告）號: CN103667428A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 王明;彭南求
• 申請（專利權）人: 上海賽安生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海唯源專利代理有限公司 31229
• 代理人: 王建國

技術領域：

本發明涉及生物技術和醫學領域，尤其是分子生物學，分子診斷，實時定量PCR技術。

背景技術：

Caveolin-1基因位于人7q31.1上，含有3個外顯子。在哺乳動物細胞內的Caveolin-1可根據N端的不同分為α型和β型(Caveolin-1α和Caveolin-1β)，它們的主要區別在DNA轉錄成mRNA時來自不同的起點。Caveolin-1α為24kDa，有178個氨基酸殘基組成；Caveolin-1β為21kDa，由147個氨基酸殘基組成。

Caveolin-1通過調控細胞周期抑制腫瘤發生。Caveolin-1正常表達后通過其N末端與周期蛋白D1（CyclinDl）基因的啟動子結合，抑制CyclinDl的活性。Caveolin-1可以隔離脂肪中的磷酸化酪氨酸蛋白激酶Fyn（同步原癌基因）和SH2攜帶蛋白（Src?homology?2?domain?containing，Shc），阻止他們與α整合素相互作用，從而抑制層粘連蛋白誘導的細胞外調節蛋白激酶（extracellular?regulated?protein?kinases,ERK）活化，通過核轉錄因子原癌基因蛋白（Jun）、即刻早期基因蛋白（Fos）和周期素D（Cyclin?D）實現對細胞周期的負調控。Caveolin-1與鳥類肉瘤Schmidt-Ruppin?A-2病毒癌基因同源物（c-Src）發生交互作用，抑制Src酪氨酸激酶的磷酸化，阻止其信號的向下傳導。Caveolin-1抑制原癌基因唾液酸酶（Neu）表達產物的自身磷酸化，阻斷Neu的信號傳導。此外，Caveolin-1還能引起表皮生長因子（Epidermal?growth?factor，EGF）、成纖維細胞生長因子（Fibroblast?growth?factor，FGF）、血小板衍生生長因子（platelet-derived?growth?factor，PDGF）和轉化生長因子等的表達下調。通過多種途徑，Caveolin-1抑制腫瘤的發生發展。

Caveolin-1基因的突變引起其表達產物表達的降低或活性的減弱，抑制其生理功能，與腫瘤的發生發展相關。在乳腺癌和胰腺癌中，Caveolin-1基因的突變率分別為35％和7％-10％。尤其是第132號密碼子的P＞L的突變，是腫瘤細胞及組織中的熱點突變。Lee等[6]在乳腺癌研究中發現Caveolin-1基因P132L的突變率達到16％。

眾所周知，高分辨熔解曲線(high-re?solution?melt，HRM)分析技術是近幾年來在國外興起的一種用于突變掃描和基因分型的最新遺傳學分析方法。它是一種高效穩健的PCR技術，不受突變堿基位點與類型局限，無需序列特異性探針，在PCR（Polymerase?Chain?Reaction）即聚合酶鏈式反應結束后直接運行高分辨熔解，即可完成對樣品突變、單核苷酸多態性-SNP、甲基化、配型等的分析。因操作簡便快速，使用成本低，結果準確，實現了真正的閉管操作，HRM技術受到普遍關注。而，高分辨率熔解曲線(HRM)是傳統的熔解曲線分析的延伸:它要求特殊的熒光染料、高性能的熒光定量PCR與專門的分析算法；使我們可以不必測序直接篩查PCR擴增產物中是否存在遺傳學變異（SNPs,mutations)。SYBR??Green?I對PCR擴增有毒性，因此必需使用低濃度的染料，又因為它是非飽和態結合，染料在熔解過程中可重新結合，使其無法適用于HRM。