[發明專利]Caveolin-1基因突變的快速檢測方法

有效

• 申請號: 201210335560.3
• 申請日: 2012-09-11
• 公開（公告）號: CN103667428A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 王明;彭南求
• 申請（專利權）人: 上海賽安生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海唯源專利代理有限公司 31229
• 代理人: 王建國

1.一種Caveolin-1基因突變的快速檢測方法，其特征在于，其包括如下實現步驟：

在Caveolin-1基因突變位點兩端設計一對野生型引物，并在突變位點上設計一對突變引物；

分別擴增出野生型模板和突變型片段，再用野生型引物對兩種突變型片段進行PCR擴增，擴增對應的突變型模板；

不同比例混合野生型模板和突變型模板，用HRM方法進行區分。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述PCR產物的高分辨率熔解曲線基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR產物的Tm取決于GC含量。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述純合子包括野生型純合子或突變純合子樣品的擴增產物進行熔解曲線，得到相似峰形的熔解曲線；雜合子樣品的擴增產物進行熔解曲線，得到不同峰形的熔解曲線。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述不同比例混合這兩種模板，使突變型模板的含量為1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法進行區分。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：設計了Caveolin-1P132L的野生型引物和突變型引物。

6.根據權利要求1所述的一種Caveolin-1基因突變的快速檢測方法，其特征在于，其包括如下步驟：?

樣本處理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4℃保存；

DNA提取：取200μL抗凝血用試劑盒提取DNA，采用電泳凝膠成像對DNA純度和濃度作檢測；

qPCR-HRM檢測，包括：對照孔的設立和檢測重復孔；10μL反應體系構成；在八連管中依照次序加入各試劑，混合均勻；所有樣本混合完后，將八連管置于羅氏熒光定量PCR系統儀器中進行程序性檢測；

結果分析及判定：在高分辨率熔解曲線分析方法中，以陽性對照孔為分界線，樣本孔與基線差異大于陽性對照孔的判定為突變型，差異小于陽性對照孔的判定為野生型。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于:所述qPCR-HRM檢測的程序包括：95℃變性10分鐘；95℃變性10秒鐘；退火采用探底式，設置探底退火溫度為55-65℃，每個循環降低1℃，時間為10秒鐘；72℃延伸30秒鐘；重復第2步到第四步45個循環;95℃變性60秒鐘；40℃變性60秒鐘；設置高分辨率熔解溫度從60℃到95℃，緩變率是0.05℃/s）。

8.根據權利要求1或6任一所述的方法，其特征在于:所述野生型目的片段的獲取包括：以已知未突變基因組為模板，Caveolin-1F+Caveolin-1R為引物進行實驗，獲得條帶單一的特異性野生型目的片段；將目的片段稀釋至1萬-10萬倍，終濃度約為10ng/μL，作為檢測野生型陰性對照模板用。

9.根據權利要求1或6任一所述的方法，其特征在于：所述Caveolin-1突變型目的片段的獲取包括：?

第一步利用帶有突變位點的突變引物（Caveolin-1P132L?F,Caveolin-1P132L?R）獲得突變位點前后兩段突變片段；

第二步將這兩段突變片段連接起來，構成Caveolin-1突變型目的片段。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

1)突變第一步PCR，以稀釋后的野生型目的片段為模板，分別以Caveolin-1F+Caveolin-1P132L?R，Caveolin-1P132L?F+Caveolin-1R為引物進行兩組實驗，獲得兩個條帶單一的片段；

2)突變第一步產物稀釋，將突變第一步獲得的兩段PCR產物稀釋1萬-10萬倍，終濃度約為10ng/μL；

3)突變第二步PCR，以稀釋后的第一步兩段產物為模板，以Caveolin-1F+Caveolin-1R為引物進行第二步PCR，獲得條帶單一的片段；

4)突變第二步產物稀釋，將突變第二步獲得的PCR產物稀釋1萬-10萬倍，終濃度約為10ng/μL。?