[發明專利]一種NKCC1基因cRNA原位雜交的探針及其設計方法

無效

• 申請號: 201210333274.3
• 申請日: 2012-09-10
• 公開（公告）號: CN103074332A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 王亞云;楊雁靈;魏燕燕;郭保霖;隋秉東;鄭晨曦;李云慶
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 西安睿通知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 61218
• 代理人: 車寧華

技術領域

本發明屬于生物醫學領域，涉及一種探針及其設計方法，尤其是一種NKCC1基因cRNA原位雜交的探針及其設計方法。?

背景技術

氯離子是細胞內最重要陰離子。在神經系統，神經元內外氯離子濃度保持相對平衡狀態，是維持神經元和局部環路形態和機能穩定的內環境基礎。一旦氯離子失去平衡，將直接導致神經系統疾病產生。目前已經發現，氯離子失衡可導致是包括帕金森病、癲癇、缺血缺氧、阿爾茨海默病、腦震蕩、神經病理性痛、脊髓損傷、糖尿病性神經病、精神分裂癥和小腦共濟失調等多種神經系統疾病的重要因素。氯離子是由細胞膜上的氯離子轉運體負責運入或者運出細胞。目前為止共克隆得到8個氯離子轉運體蛋白分子：包括2個NKCC蛋白、4個KCC蛋白、1個NCC蛋白以及1個CIP蛋白。NKCC1是神經系統內最重要的降低神經元內氯離子濃度的蛋白。NKCC1全名為鉀濃度梯度驅動的氯離子外向轉運體。NKCC1的工作原理是：按1∶1的比例將1個鉀離子轉運入胞體，同時將1個氯離子轉運出胞體。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種NKCC1基因cRNA原位雜交的探針及其設計方法。?

本發明的目的是通過以下技術方案來解決的：?

一種NKCC1基因cRNA原位雜交的探針，該探針的序列為：?

5'att?gtgggaattt?gtaatatcag?aagcaaaacg?gtttctcaca?cactgctgtt?ttgatagtgctgtagttgg?tttgacatcg?attctctcct?ttctcagtct?ctgtagactg?aagtggataa?cggatcgggtcatttgcctc?ttctcagagt?gttttcacta?ttgaaagtgt?ggtacagata?cattgcacgt?tgttctccacggccaggtag?tttagcagga?atctgtggtt?accccgaaga?tttagaaaga?ctttcacctg?

gaggctgtaa?tgcgcctgga?acctacctag?atgcttccta?gggacatgtt?ttgtttctgt?tttaattcaaatctcagtaa?caaagcccta?caggttctca?aagctgtagg?ttttgttttt?ggtgtgcctg?ttcttggcatttttggtagt?gtccagaaaa?cagcacttgt?gtggcagttg?aaggagtggg?cctgagccgcctgagctccc?tgggaaggtt?agaaagaagt?gcgg?3'。?

所述探針的設計方法，按照如下步驟：?

(1)根據NKCC1的Gene?bank序列我們設計了NKCC1特異的引物，并且此對引物擴增出437bp的NKCC1片段作為NKCC1特異的探針序列；?

(2)構建NKCC1的cRNA原位雜交的探針質粒；將探針質粒轉化細菌后，細菌培養后進行測序；?

(3)制備NKCC1的cRNA原位雜交探針；?

(4)檢測NKCC1的cRNA探針的原位雜交。?

所述步驟(1)中NKCC1特異的引物是：?

上游引物是5'GAC?ACC?CAC?ACC?AAC?ACC?TA?3'；?

下游引物是5'GTA?CGC?TCC?TCC?TCC?TCT?CA?3'。?

所述步驟(2)按照如下步驟進行：?

(a)將小鼠的cDNA用設計的引物進行PCR擴增；?

(b)將PCR產物用TIANGEN膠回收試劑盒進行膠回收；?

(c)將回收后的產物于4℃與多克隆位點兩端具有T7，SP6啟動子的載體進行連接；?

(d)將連接好的質粒轉化細菌后，細菌培養后進行測序。?

所述步驟(3)按照如下步驟進行：?

(a)步驟(2)的到的細菌測序正確后，經判斷確認NKCC1探針序列插入載體的順序是反向的；?

(b)需要使用XbaⅠ限制性內切酶對質粒進行酶切；?

(c)將酶切產物用TIANGEN膠回收試劑盒進行膠回收；?

(d)用T7RNA聚合酶對探針進行體外轉錄標記。?

所述步驟(4)按照如下步驟進行：?

(a)將小鼠用0.4%戊巴比妥鈉深麻后，經左心室插管至升主動脈，用0.01mol/L的DEPC-PBS的快速沖洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定；?