[發(fā)明專(zhuān)利]一種NKCC1基因cRNA原位雜交的探針及其設(shè)計(jì)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210333274.3
• 申請(qǐng)日: 2012-09-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103074332A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王亞云;楊雁靈;魏燕燕;郭保霖;隋秉東;鄭晨曦;李云慶
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/11
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 西安睿通知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 61218
• 代理人: 車(chē)寧華

1.一種NKCC1基因cRNA原位雜交的探針，該探針的序列為：

5'att?gtgggaattt?gtaatatcag?aagcaaaacg?gtttctcaca?cactgctgtt?ttgatagtgctgtagttgg?tttgacatcg?attctctcct?ttctcagtct?ctgtagactg?aagtggataa?cggatcgggtcatttgcctc?ttctcagagt?gttttcacta?ttgaaagtgt?ggtacagata?cattgcacgt?tgttctccacggccaggtag??tttagcagga??atctgtggtt??accccgaaga??tttagaaaga??ctttcacctg

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2.如權(quán)利要求1所述探針的設(shè)計(jì)方法，其特征在于：

(1)根據(jù)NKCC1的Gene?bank序列設(shè)計(jì)NKCC1特異的引物，并且此對(duì)引物擴(kuò)增出437bp的NKCC1片段作為NKCC1特異的探針序列；

(2)構(gòu)建NKCC?1的cRNA原位雜交的探針質(zhì)粒；將探針質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，細(xì)菌培養(yǎng)后進(jìn)行測(cè)序；

(3)制備N(xiāo)KCC?1的cRNA原位雜交探針；

(4)檢測(cè)NKCC1的cRNA探針的原位雜交。

3.如權(quán)利要求2所述的設(shè)計(jì)方法，其特征在于，所述步驟(1)中NKCC1特異的引物是：

上游引物是5'GAC?ACC?CAC?ACC?AAC?ACC?TA?3'；

下游引物是5'GTA?CGC?TCC?TCC?TCC?TCT?CA?3'。

4.如權(quán)利要求2所述的設(shè)計(jì)方法，其特征在于，所述步驟(2)按照如下步驟進(jìn)行：

(a)將小鼠的cDNA用NKCC1特異的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(b)將PCR產(chǎn)物用TIANGEN膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收；

(c)將回收后的產(chǎn)物于4℃與多克隆位點(diǎn)兩端具有T7、SP6啟動(dòng)子的載體進(jìn)行連接；

(d)將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，細(xì)菌培養(yǎng)后進(jìn)行測(cè)序。

5.如權(quán)利要求2所述的設(shè)計(jì)方法，其特征在于，所述步驟(3)按照如下步驟進(jìn)行：

(a)步驟(2)得到的細(xì)菌測(cè)序正確后，經(jīng)判斷確認(rèn)NKCC?1探針序列插入載體的順序是反向的；

(b)需要使用XbaⅠ限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切；

(c)將酶切產(chǎn)物用TIANGEN膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收；

(d)用T7RNA聚合酶對(duì)探針進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記。

6.如權(quán)利要求2所述的設(shè)計(jì)方法，其特征在于，所述步驟(4)按照如下步驟進(jìn)行：

(a)將小鼠用0.4%戊巴比妥鈉深麻后，經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈，用0.01mol/L的DEPC-PBS的快速?zèng)_洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定；所述的0.01mol/L?DEPC-PBS是2.9克磷酸氫二鈉，0.29克磷酸二氫鈉，9.0克氯化鈉用超純水定容至1L后，再加入體積百分比為0.1%的DEPC?1ml過(guò)夜放置后，高壓滅菌制成的磷酸鹽緩沖液；所述4%的多聚甲醛是40.0克多聚甲醛加入500.0ml蒸餾水加熱使之解聚溶解后，再加入500.0ml的0.2mol/L?PB緩沖液定容至1000ml；所述0.2mol/L?PB緩沖液是用29.01克磷酸氫二鈉，2.96克磷酸二氫鈉加超純水定容至500ml；

(b)取材后進(jìn)行腦組織的后固定：于4℃，用4%的多聚甲醛后固定24小時(shí)；

(c)將固定好的組織進(jìn)行切片：將組織切成25~30μm組織切片，并將切好的切片保存與0.01mol/L的DEPC-PBS中，放于4℃冰箱備用；

(d)將切好的組織片用0.01mol/L的DEPC-PBS清洗1次，室溫，每次5-10分鐘；

(e)將上述清洗過(guò)的片子用5x?SSC清洗2次，室溫，每次5-10分鐘；所述5x?SSC是由20x?SSC用超純水稀釋的，20x?SSC為一種緩沖液；

(f)將5x?SSC清洗后的組織片浸入預(yù)雜交液中，于55℃，在雜交爐孵育1-2小時(shí)；所述預(yù)雜交液是由5ml的去離子甲酰胺，2.5ml的20x?SSC溶液，200μl的50x?Denhardt’s溶液，50μl的濃度為200mg/ml的Heperine溶液，100μl的濃度為10mg/ml的tRNA溶液，100μl的濃度為10%的CHAPS溶液，100μl的濃度為10%的Tween-20溶液，100μl的濃度為0.5mol/L的EDTA溶液和1.85ml的DEPC-H₂O混合配置而成；

(g)將預(yù)雜交孵育后的組織切片浸入雜交液中，于55℃，在雜交爐中孵育16-20小時(shí)；所述雜交液是上述預(yù)雜交液中加入終濃度為1.0ug/ml的cRNA探針配置成的；

(h)雜交后用1x?SSC洗滌雜交的組織切片，37℃，2次，每次10分鐘；

(i)用2x?SSC洗滌上述的組織切片，37℃，2次，每次10-15分鐘；

(j)用10ug/ml的RNase?A處理，37℃，1次，每次30-40分鐘；

(k)用2x?SSC洗滌上述的組織切片，室溫，1次，每次10分鐘；

(l)用0.01mol/L?PBS洗滌上述的組織切片，室溫，1次，每次10分鐘；所述0.01mol/L?PBS是2.9克磷酸氫二鈉，0.29克磷酸二氫鈉，9.0克氯化鈉用超純水定容至1L配置的磷酸緩沖液；

(m)按1:2000的抗體效價(jià)，在PBS溶液中加入Anti-Digoxigenin–AP抗體，對(duì)洗滌后的組織切片進(jìn)行孵育，室溫，放置過(guò)夜；

(n)將經(jīng)過(guò)上步抗體孵育的組織片進(jìn)行PBS的洗滌，于室溫，清洗3次，每次10-15分鐘；

(o)用TS9.5洗滌上述PBS洗滌后的組織片，室溫，清洗2次，每次15-20分鐘；所述TS9.5為是由終濃度為摩爾濃度為0.1mol/LTris-HCl、PH?9.5,摩爾濃度為0.1mol/L?NaCl溶液和摩爾濃度為50mmol/L?MgCL₂用超純水配制而成；

(p)將上述切片放于NBT-BCIP反應(yīng)液中避光孵育4~6小時(shí)，在此過(guò)程中觀察切片呈色強(qiáng)度；所述NBT-BCIP是一種Roche公司生產(chǎn)的呈色反應(yīng)液；

(q)當(dāng)呈色完成后，將切片用PBS清洗3次，室溫，每次10-15分鐘；

(r)將上述洗滌后切片表于載玻片上；

(s)晾干切片，再經(jīng)過(guò)二甲苯脫色，封片，以備觀察。