[發明專利]一種葉酸修飾殼聚糖包裹質粒納米粒子及其制備方法

有效

• 申請號: 201210333201.4
• 申請日: 2012-09-11
• 公開（公告）號: CN102824306A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 盧小玲;趙永祥
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: A61K9/10
• 分類號: A61K9/10;A61K9/14;A61K48/00;A61K38/19;A61K47/36;A61P35/00;C08B37/08
• 代理公司: 深圳市順天達專利商標代理有限公司 44217
• 代理人: 郭偉剛;周嬌嬌

技術領域

本發明屬于生物材料的醫學基礎應用領域，更具體地說，涉及一種葉酸修飾殼聚糖包裹質粒納米粒子的制備方法。

背景技術

肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，根據最新統計，全世界每年新發肝癌患者約六十萬，居惡性腫瘤的第三位。原發性肝癌在我國屬于高發病，一般男性多于女性。目前我國發病人數約占全球的半數以上，占全球肝癌病人的55%，已經成為嚴重威脅我國人民健康和生命的一大殺手。

早期肝癌以手術治療為主，但由于起病隱匿，早期癥狀不典型且診斷困難，確診時大多數患者已達到晚期失去手術機會。肝癌對放化療均不敏感，目前主要依賴介入（TACE）或藥物輔助治療，預后極差。目前已知肝癌的發生發展與轉移和多種基因突變、信號轉導通路和新生血管增生異常密切相關，這些發病機理為分子靶向治療提供許多有利的靶點，逐漸成為新的研究靶點。

在肝癌的過繼免疫治療方面，腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic?T?lymphocyte，CTL）被作為治療研究領域之一，治療的方向放在誘導T細胞及NK細胞分泌IFN-γ及促進CTL成熟，并且誘導更強的抗血管效應。但這種療法也有其缺陷性，原因是靶向到腫瘤局部的特異性CTL細胞數量有限，影響到免疫治療的效果。故人們開始研究一種基于趨化因子干擾素誘導蛋白10（IP10），作為促進T細胞的定向趨化和活化增殖的促進劑。

IP10具有強大的趨化淋巴細胞和活化功能，可以定向募集T淋巴細胞并促進淋巴細胞活化和增殖，引起腫瘤內淋巴細胞浸潤，并且具有抑制腫瘤新生血管生成的作用，從而發揮較強的抗腫瘤作用。在借助IP10的趨化作用下，CTL即可從注射部位靶向富集到腫瘤周圍特別是侵潤的腫瘤細胞周圍，故目前主要通過轉基因技術或者直接腫瘤局部多點注射等方法使腫瘤局部富集IP10。但這些方法存在靶向性、濃度以及體內降解等問題，不能很好的富集到腫瘤細胞局部。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于，針對現有肝癌的過繼免疫治療中藥物靶向性較差的缺陷，提供一種葉酸修飾殼聚糖包裹質粒納米粒子及其制備方法。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：構造一種葉酸修飾的殼聚糖包裹質粒納米粒子的制備方法，包括以下步驟：

S1、將脫乙酰度大于95%的殼聚糖粉末溶解在含1%的醋酸溶液中，制備成5mg/mL的殼聚糖溶液，并調節pH值至4.9-5.2；在持續勻速攪拌作用下，將2mg/mL的三聚磷酸鈉溶液按照1.0:(1.2-2.0)的體積比逐滴滴入所述殼聚糖溶液中，形成物理交聯后的殼聚糖溶液；

S2、在持續勻速攪拌作用下，將5wt%的戊二醛溶液按照1:12-15的體積比逐滴加入到所述物理交聯后的殼聚糖溶液中，37°C水浴震蕩過夜，得到化學交聯后的殼聚糖溶液，并加入過量的NaBH4粉末；

S3、對步驟S2制得的殼聚糖溶液進行透析純化，得到殼聚糖納米粒子懸浮液；

S4、用磷酸緩沖液將葉酸配成5mg/ml的葉酸溶液；將所述葉酸溶液、殼聚糖納米粒子懸浮液以及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽按質量比為10:1:5混合，在勻速攪拌作用下，室溫反應30min；透析去除未反應的葉酸，得到葉酸修飾的殼聚糖納米粒子懸浮液；

S5、將IP10質粒用25mmol/L的Na₂SO₄溶液稀釋至1mg/ml后與所述殼聚糖納米粒子懸浮液分別置于55°C水浴5-20min，按質量比為10:1迅速混合后，在渦輪振蕩器上以2000rpm的震蕩速率震蕩30-50秒，室溫下靜置30min；并在4°C下>10,000g離心20min，然后用磷酸緩沖液重懸，形成乳白色懸液，制得葉酸修飾的殼聚糖包裹質粒納米粒子。

在根據本發明所述的葉酸修飾的殼聚糖包裹質粒納米粒子的制備方法中，所述步驟S1中用1mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值至4.9-5.2，所述持續勻速攪拌為500rpm，所述逐滴滴入為1滴/秒的速率。

在根據本發明所述的葉酸修飾的殼聚糖包裹質粒納米粒子的制備方法中，所述步驟S2中所述水浴震蕩的震蕩速率為120rpm。

在根據本發明所述的葉酸修飾的殼聚糖包裹質粒納米粒子的制備方法中，所述步驟S3中透析純化使用的透析袋的截留分子量為8000-14000，透析時間為2小時。

在根據本發明所述的葉酸修飾的殼聚糖包裹質粒納米粒子的制備方法中，所述步驟S4中所述勻速攪拌的速度為200rpm；所述透析去除未反應的葉酸使用截留分子量為8000-14000的透析袋。