[發明專利]一種PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 201210330990.6
• 申請日: 2012-10-18
• 公開（公告）號: CN102851368A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 邵琦
• 申請（專利權）人: 廣州達健生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 劉孟斌

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種檢測基因突變的熒光定量PCR試劑盒及其檢測方法，尤其涉及一種PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測試劑盒及其檢測方法。?

背景技術

PIK3CA(phosphatidylinositol?3-kinase?catalytic?alpha)是由Volinia等1994年利用原位雜交技術檢測到的，是新近發現的一種體細胞突變的癌基因，其可能通過參與PIK3/AKT細胞信號轉導途徑調節細胞的生長和凋亡。研究證明PIK3CA與多種惡性腫瘤有關，如結直腸癌、宮頸癌、乳腺癌、肺癌等。目前關于癌基因PIK3CA與腫瘤的關系及其致瘤機制都成為人們研究腫瘤的一個熱點。人類腫瘤的發生是一個多基因、多機制參與的過程，癌基因PIK3CA的發現為我們研究腫瘤的發生發展提供了新的方向。研究腫瘤不同階段中PIK3CA突變的規律及其預后的關系，對于臨床早期檢測腫瘤及判斷預后有重要的意義。?

癌基因PIK3CA是在關于PI3Ks家族與腫瘤的發生關系及其機制的研究中發現的。PIK3CA基因定位于3q26.3，長34kb，包含20個外顯子，編碼1068種氨基酸，該組氨基酸產生一組長124kD的蛋白。PIK3CA編碼Ⅰ類磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylino-sitol?3-kinases,PI3Ks)的p?110催化亞單位，即PI3Kp110a。Broderick等研究發現PIK3CA是一種癌基因，生理情況下，基因PIK3CA在正常腦、肺、乳腺、胃腸、宮頸、卵巢等組織中均有表達，具有調控體細胞增殖、分化、存活等許多重要的生理功能，但多以非激活的形式存在，通常不易檢測到，而其突變后基因及其蛋白均可過度表達，可被檢測到。研究表明，PIK3CA基因的突變不僅可以引起PI3Ks的催化活性增強，并且可促進細胞癌變。?

根據PIK3CA基因在結直腸癌中高頻突變，并激活PI3K/AKT信號傳導通路這一研究成果，阻斷該信號通路對AKT的磷酸化有望成為治療結直腸癌的一條有效途徑。發現PIK3CA基因突變在結腸癌癌變過程中的作用，進一步認識癌基因PIK3CA突變作用對于揭示大腸癌發生發展的分子機制具有重要意義，為結腸癌的早期發現、早期治療及預后提供理論依據。癌基因PIK3CA編碼的蛋白PI3Kp110a在大腸癌變不同階段的表達差異提示檢測PI3Kp110a反應癌基因PIK3CA的突變，可成為預測腫瘤分化，判斷大腸癌預后的一個重要指標，也為臨床早期警示大腸癌變提供了依據。?

另外，PIK3CA在宮頸癌組織中表達明顯高于正常組織，PIK3CA基因的表達產物PI3Kp110a蛋白在正常宮頸和CIN?Ⅰ組、CIN?Ⅱ組和CINⅢ組與宮頸浸潤癌組織間均有顯著性差異。說明在宮頸癌形成過程中存在PIK3CA的表達異常，而PIK3CA與宮頸不典型增生演化到宮頸癌有關，有可能成為宮頸癌早期診斷的指標。赫賽汀(Herceptin)是一種抗HER2單克隆抗體，可選擇性作用于人類表皮生長因子受體2（HER2），從而干擾癌細胞的生物學進程，抑制癌細胞的增生，赫賽汀用于治療轉移性乳腺癌，以及手術后的HER2陽性乳腺癌患者。研究發現赫賽汀對PIK3CA基因突變人群的療效欠佳。PIK3CA基因突變檢測可為乳腺癌患者的合理使用赫賽汀用藥提供參考依據。?

PIK3CA熱點區高突變率的發現對臨床上腫瘤的診斷，預測預后和治療有重要作用。為此，本領域技術人員也開發了一些檢測PIK3CA基因突變熱點區的方法和試劑，以增加腫瘤在組織學上的診斷敏感性。其中，檢測PIK3CA基因突變的方法有傳統的PCR-SSCP直接測序法。直接測序法的結果雖然具有客觀性和特異性，但是它卻存在以下缺點：?

1、檢測周期長，從標本送檢到得出結果最短要48－72個小時左右；?

2、操作過程復雜，且要涉及到PCR擴增后的操作，因此易被污染，造成結果的不理想（詳見F項）；?

3、測序結果的判讀較復雜、費時（當樣本量大時，此點尤為突出，詳見F項）；?

4、檢測的敏感性不夠高，Katsuhiko等人曾在2005年8月份出版的《LungCancer》上報道，如果突變基因的含量占基因組DNA總量的10％以下時，則用直接測序法檢測不到突變樣本的存在；?

5、一次實驗檢測的樣本量有限，最多只能8-24例；?

6、不安全，整個實驗過程要用到多種有毒物質，如EB、丙烯酰胺等，對操作者和環境都有危害；?

7、費用較高(每個位點約需300元)。?

發明內容