[發(fā)明專(zhuān)利]一種PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210330990.6
• 申請(qǐng)日: 2012-10-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102851368A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-01-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邵琦
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣州達(dá)健生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 廣州三環(huán)專(zhuān)利代理有限公司 44202
• 代理人: 劉孟斌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)基因突變的熒光定量PCR試劑盒及其檢測(cè)方法，尤其涉及一種PIK3CA基因突變熒光定量PCR分型檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。?

背景技術(shù)

PIK3CA(phosphatidylinositol?3-kinase?catalytic?alpha)是由Volinia等1994年利用原位雜交技術(shù)檢測(cè)到的，是新近發(fā)現(xiàn)的一種體細(xì)胞突變的癌基因，其可能通過(guò)參與PIK3/AKT細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡。研究證明PIK3CA與多種惡性腫瘤有關(guān)，如結(jié)直腸癌、宮頸癌、乳腺癌、肺癌等。目前關(guān)于癌基因PIK3CA與腫瘤的關(guān)系及其致瘤機(jī)制都成為人們研究腫瘤的一個(gè)熱點(diǎn)。人類(lèi)腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多基因、多機(jī)制參與的過(guò)程，癌基因PIK3CA的發(fā)現(xiàn)為我們研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了新的方向。研究腫瘤不同階段中PIK3CA突變的規(guī)律及其預(yù)后的關(guān)系，對(duì)于臨床早期檢測(cè)腫瘤及判斷預(yù)后有重要的意義。?

癌基因PIK3CA是在關(guān)于PI3Ks家族與腫瘤的發(fā)生關(guān)系及其機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)的。PIK3CA基因定位于3q26.3，長(zhǎng)34kb，包含20個(gè)外顯子，編碼1068種氨基酸，該組氨基酸產(chǎn)生一組長(zhǎng)124kD的蛋白。PIK3CA編碼Ⅰ類(lèi)磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylino-sitol?3-kinases,PI3Ks)的p?110催化亞單位，即PI3Kp110a。Broderick等研究發(fā)現(xiàn)PIK3CA是一種癌基因，生理情況下，基因PIK3CA在正常腦、肺、乳腺、胃腸、宮頸、卵巢等組織中均有表達(dá)，具有調(diào)控體細(xì)胞增殖、分化、存活等許多重要的生理功能，但多以非激活的形式存在，通常不易檢測(cè)到，而其突變后基因及其蛋白均可過(guò)度表達(dá)，可被檢測(cè)到。研究表明，PIK3CA基因的突變不僅可以引起PI3Ks的催化活性增強(qiáng)，并且可促進(jìn)細(xì)胞癌變。?

根據(jù)PIK3CA基因在結(jié)直腸癌中高頻突變，并激活PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路這一研究成果，阻斷該信號(hào)通路對(duì)AKT的磷酸化有望成為治療結(jié)直腸癌的一條有效途徑。發(fā)現(xiàn)PIK3CA基因突變?cè)诮Y(jié)腸癌癌變過(guò)程中的作用，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)癌基因PIK3CA突變作用對(duì)于揭示大腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制具有重要意義，為結(jié)腸癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療及預(yù)后提供理論依據(jù)。癌基因PIK3CA編碼的蛋白PI3Kp110a在大腸癌變不同階段的表達(dá)差異提示檢測(cè)PI3Kp110a反應(yīng)癌基因PIK3CA的突變，可成為預(yù)測(cè)腫瘤分化，判斷大腸癌預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)，也為臨床早期警示大腸癌變提供了依據(jù)。?

另外，PIK3CA在宮頸癌組織中表達(dá)明顯高于正常組織，PIK3CA基因的表達(dá)產(chǎn)物PI3Kp110a蛋白在正常宮頸和CIN?Ⅰ組、CIN?Ⅱ組和CINⅢ組與宮頸浸潤(rùn)癌組織間均有顯著性差異。說(shuō)明在宮頸癌形成過(guò)程中存在PIK3CA的表達(dá)異常，而PIK3CA與宮頸不典型增生演化到宮頸癌有關(guān)，有可能成為宮頸癌早期診斷的指標(biāo)。赫賽汀(Herceptin)是一種抗HER2單克隆抗體，可選擇性作用于人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2），從而干擾癌細(xì)胞的生物學(xué)進(jìn)程，抑制癌細(xì)胞的增生，赫賽汀用于治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌，以及手術(shù)后的HER2陽(yáng)性乳腺癌患者。研究發(fā)現(xiàn)赫賽汀對(duì)PIK3CA基因突變?nèi)巳旱寞熜芳选IK3CA基因突變檢測(cè)可為乳腺癌患者的合理使用赫賽汀用藥提供參考依據(jù)。?

PIK3CA熱點(diǎn)區(qū)高突變率的發(fā)現(xiàn)對(duì)臨床上腫瘤的診斷，預(yù)測(cè)預(yù)后和治療有重要作用。為此，本領(lǐng)域技術(shù)人員也開(kāi)發(fā)了一些檢測(cè)PIK3CA基因突變熱點(diǎn)區(qū)的方法和試劑，以增加腫瘤在組織學(xué)上的診斷敏感性。其中，檢測(cè)PIK3CA基因突變的方法有傳統(tǒng)的PCR-SSCP直接測(cè)序法。直接測(cè)序法的結(jié)果雖然具有客觀性和特異性，但是它卻存在以下缺點(diǎn)：?

1、檢測(cè)周期長(zhǎng)，從標(biāo)本送檢到得出結(jié)果最短要48－72個(gè)小時(shí)左右；?

2、操作過(guò)程復(fù)雜，且要涉及到PCR擴(kuò)增后的操作，因此易被污染，造成結(jié)果的不理想（詳見(jiàn)F項(xiàng)）；?

3、測(cè)序結(jié)果的判讀較復(fù)雜、費(fèi)時(shí)（當(dāng)樣本量大時(shí)，此點(diǎn)尤為突出，詳見(jiàn)F項(xiàng)）；?

4、檢測(cè)的敏感性不夠高，Katsuhiko等人曾在2005年8月份出版的《LungCancer》上報(bào)道，如果突變基因的含量占基因組DNA總量的10％以下時(shí)，則用直接測(cè)序法檢測(cè)不到突變樣本的存在；?

5、一次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的樣本量有限，最多只能8-24例；?

6、不安全，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程要用到多種有毒物質(zhì)，如EB、丙烯酰胺等，對(duì)操作者和環(huán)境都有危害；?

7、費(fèi)用較高(每個(gè)位點(diǎn)約需300元)。?

發(fā)明內(nèi)容