[發(fā)明專利]一種利用脂肪酰ACP還原酶生物合成脂肪醇的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210330969.6
• 申請日: 2012-09-07
• 公開（公告）號: CN102827880A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉天罡;劉然;付愛思
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢大學
• 主分類號: C12P7/02
• 分類號: C12P7/02;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12N15/53;C12N9/02
• 代理公司: 武漢科皓知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 薛玲

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于可再生能源和生物質(zhì)能源以及化工原料生產(chǎn)領(lǐng)域，具體涉及改造異養(yǎng)微生物自身脂肪酸代謝途徑從而生產(chǎn)脂肪醇的方法。

背景技術(shù)

脂肪醇(fatty?alcohols)是洗滌劑用表面活性劑的原料之一，在洗滌劑、護膚品、化妝品、藥品中有大量運用。脂肪醇最早是由鯨蠟制取的，所得的混合脂肪醇經(jīng)磺化中和后成為硫酸鹽，是最早的一種陰離子洗滌劑。其后開發(fā)利用來源比較豐富的椰子油、棕櫚油和牛油為原料，水解所得脂肪酸再還原為醇，統(tǒng)稱為天然脂肪醇。石油化學工業(yè)發(fā)展后，以石油產(chǎn)品為原料，生產(chǎn)的脂肪醇稱為合成脂肪醇。全世界總的脂肪醇消費量大約在250萬噸左右。至20世紀末，天然醇與合成醇的比例大致為4.9∶5.1。近年來由于石油原料價格持續(xù)高漲，加上美洲和亞洲地區(qū)對脂肪醇的需求增加，以及人們對天然原料脂肪醇的偏好，增加了對天然脂肪醇的需求。脂肪醇的價格已高達2000美元每噸，目前全球有許多國家依然需要依靠進口滿足脂肪醇的需求。但是依靠石油產(chǎn)品為原料的脂肪醇也大量消耗石油的儲備量，在資源日益稀缺的今天，這種發(fā)展方式將會逐漸淘汰，因此，需要一種更環(huán)保、可再生的生產(chǎn)方式。如果能夠通過在改造后的脂肪酸代謝通路中異源表達脂肪醇合成酶，即脂肪酰載體蛋白還原酶，即可以通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生大量的脂肪醇。

Michael等人在2000年純化了jojoba的fatty?acyl?CoA?reductase,并證明該基因——jojoba?far能將脂肪酸還原成為脂肪醇，該工作發(fā)表在“Plant?Physiology”（James?G.Metz,Michael?R.Pollard?1,LanaAnderson,Thomas?R.Hayes,and?Michael?W.Lassner.2000.Purification?of?ajojoba?embryo?fatty?acyl-Coenzyme?A?reductase?and?expression?ofits?cDNA?in?high?erucic?acid?rapeseed.Vol.122:635–644）。Tan等在缺乏合成脂肪醇能力的藍細菌Syn-LY2菌株中分別表達了來自于jojoba,鼠，擬南芥等的脂肪酰輔酶A還原酶FAR，發(fā)現(xiàn)異源表達jojoba及其中一種擬南芥FAR的藍細菌能夠合成脂肪醇，而異源表達其他的幾種FAR的藍細菌不能產(chǎn)生脂肪醇。該工作發(fā)表在“Metabolic?Engineering”上（Tan?X,Yao?L,Lu?X.et?al.2010.Photosynthesis?driven?conversion?of?carbon?dioxide?to?fatty?alcohols?and?hydrocarbons?in?cyanobacteria.Metabolic?Engineering?13(2011)169–176）。劉天罡教授等人開發(fā)了一個“cell?free”體系，將脂肪酸代謝途徑中的限速步驟進行了研究，指導如何提高微生物體內(nèi)的脂肪酸含量，該工作發(fā)表于“Metabolic?Engineering”(Tiangang?Liu,Harmit?Vora,Chaitan?Khosla.2010.Quantitative?analysis?and?engineering?of?fatty?acid?biosynthesis?in?E.coli.Metabolic?Engineering?12:378–386)。2011年，研究人員克隆并鑒定了一個參與單子葉植物水稻花藥及花粉外壁發(fā)育的脂肪酰基載體蛋白還原酶DPW，研究揭示，DPW蛋白定位于質(zhì)體中，重組蛋白可以脂肪酰基載體蛋白為底物，將碳十六脂肪酸還原為其相應(yīng)的脂肪醇，從而參與花藥及花粉外壁的合成，并且通過遺傳互補等實驗證明DPW在雙子葉植物擬南芥中具有保守的生物學功能（Shi?J,Tan?H,Yu?XH,Liu?Y,Liang?W,Ranathunge?K,et?al.Defective?pollen?wall?is?required?for?anther?and?microspore?development?in?rice?and?encodes?a?fatty?acyl?carrier?protein?reductase.The?Plant?cell?2011;23:2225-46）。2010年，Andreas?Schirmer等在Science上發(fā)表一項工作，其中證明了來自于藍細菌PCC7942的一段基因序列PCC7942-orf1594（AAR基因）和PCC7942-orf1593共表達可以產(chǎn)生脂肪烷烴（Schirmer?A,Rude?MA,Li?X,Popova?E,del?Cardayre?SB.Microbial?biosynthesis?of?alkanes.Science?2010;329:559-62）。脂酰載體蛋白還原酶基因便于進行優(yōu)化，目前可以進行遺傳操縱的微生物種類繁多，脂肪酸合成代謝途徑又是每種微生物生存的必需條件，并且目前的研究已經(jīng)對該條途徑認識較為深刻，其限速步驟基本清楚，利于進行改造。眾所周知，由于異養(yǎng)微生物或異養(yǎng)細胞生長迅速并且需要外源補充營養(yǎng)物質(zhì)，這就便于通過補充培養(yǎng)基或者增加某些營養(yǎng)成分來提高其生產(chǎn)能力，使其在工業(yè)上實現(xiàn)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。并且由于其必須依賴人工補給養(yǎng)料，所以可以嚴格控制其生產(chǎn)的各個階段，防止其肆意生長而造成無法控制的局面。目前工業(yè)上已經(jīng)有許多利用異養(yǎng)微生物生產(chǎn)發(fā)酵獲得產(chǎn)品的成功實例，利用脂酰載體蛋白還原酶基因在異養(yǎng)微生物體內(nèi)通過改造其自身代謝途徑生產(chǎn)脂肪醇有很大的應(yīng)用前景。