[發明專利]一種子宮頸癌熒光原位雜交檢測試劑盒及其制備方法

無效

• 申請號: 201210329753.8
• 申請日: 2012-09-07
• 公開（公告）號: CN102925553A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 李明;何瑰;陳華云
• 申請（專利權）人: 中山大學達安基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/10;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種輔助子宮頸癌早期診斷及治療選擇的hWAPL基因熒光原位雜交檢測試劑盒，包括：1)雜交緩沖液、熒光標記探針混合物、未標記的競爭性DNA、DAPI復染劑，和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其特征在于熒光標記探針混合物包含hWAPL基因探針和10號染色體著絲粒探針，每人份熒光標記探針混合物中GSP?hWAPL和CSP10因探針的使用量均為0.5μl。

2.根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于未標記的競爭性DNA為Human?COT-1DNA。

3.根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于雜交緩沖液的組分包括去離子甲酰胺，SSC，硫酸葡聚糖，其中去離子甲酰胺濃度為50％～70％，硫酸葡聚糖濃度為0.1g/ml。

4.根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于DAPI復染劑配制方法為50～250ng?DAPI溶于1ml抗褪色液(10mg/ml對苯二胺/PBS，甘油混合液)。

5.一種制備權利要求1試劑盒所述hWAPL基因探針和10號染色體著絲粒探針的方法，如下：

(1)片段篩選：通過NCBI?Mapview數據庫檢索所有含有hWAPL基因的克隆，并對這些克隆進行篩選，選擇最優的克隆；通過NCBI?Mapview數據庫檢索10號染色體重復區域序列，并進行重復性分析，選擇引物設計區域

(2)培養鑒定：按照hWAPL篩選確定的克隆編號購買克隆Invitrogen?RPCI11.C，常規培養，使用針對hWAPL基因區域的STS引物進行PCR擴增，并通過2％瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物片段進行分析，從而完成待選hWAPL克隆的鑒定；CSP10以人基因組DNA為模板，利用設計的引物對進行PCR反應，通過電泳進行鑒定；將目的產物進行克隆、培養，從而完成待選CSP10片段鑒定

(3)探針制備：對鑒定陽性的菌液，進行質粒DNA的提取；通過OD值的測定對質粒DNA進行定量；然后，通過切口平移方法對質粒DNA進行熒光標記；對標記產物進行純化

(4)探針驗證：使用人類正常分裂中期淋巴細胞滴片進行探針驗證。

6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征還在于克隆篩選步驟中篩選含有hWAPL基因最優的克隆，編號為RP11-383M14(chr10：88159615..88339509)。

7.根據權利要求5所述的制備方法，其特征還在于包含hWAPL基因片段的克隆培養和鑒定步驟中使用的STS引物對序列分別為：上游引物5’-ATGAATAGGCAGGCTGAGGATTT-3’和下游引物5’-TGACTCAGCCAAACCTTCTTAGG-3’；PCR擴增條件為：94℃5分鐘，(94℃30秒，58℃30秒，72℃45秒)×35循環，72℃7分鐘。

8.根據權利要求5所述的制備方法，其特征還在于制備CSP10探針的引物對序列為：

上游引物5’-TGGATAATTGGCCCTCTTTGA-3’和下游引物5’-TTTCCATGTCTAAGATTGGCGT-3’；PCR擴增條件為：94℃5分鐘，(94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒)×35循環，72℃7分鐘。

9.根據權利要求5所述的制備方法，其特征還在于探針制備過程中50μl切口平移體系中DNA聚合酶I使用量在10U～20U間，DNase?I使用量在0.001U～0.01U間。

10.根據權利要求5所述的制備方法，其特征還在于探針標記的熒光素為熒光素標記的dUTP，并優選Spectrum?dUTP。

11.根據權利要求5所述的制備方法，其特征還在于探針濃縮方法為乙醇沉淀濃縮，最后使用1～2μl滅菌純化水或Human?Cot-1DNA(1μg/μl)溶解沉淀。