[發(fā)明專利]表達(dá)小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的重組腺病毒及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210329633.8
• 申請(qǐng)日: 2012-09-09
• 公開（公告）號(hào): CN102827875A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭良榮;韓杰;張媛媛;孫澤瑋;王利宏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/861
• 分類號(hào): C12N15/861;C12N15/66;A61K48/00;A61P3/10;A61P9/10
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域，旨在提供一種攜帶小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve?growth?factor,?NGF）的重組腺病毒及其制備方法，為進(jìn)一步研究神經(jīng)生長(zhǎng)因子的基因治療奠定基礎(chǔ)。

背景技術(shù)

冠心病和糖尿病往往相互伴隨，冠心病患者中60%-80%存在血糖升高，糖尿病患者80%死于冠心病，糖尿病合并冠心病對(duì)糖尿病患者的健康構(gòu)成了極大的威脅。糖尿病容易合并冠心病、心肌缺血的機(jī)制與糖尿病神經(jīng)末梢病變有關(guān)。國(guó)內(nèi)王利宏等報(bào)道感覺(jué)神經(jīng)末梢大量分布于心血管系統(tǒng)，包括許多血管的外膜和心臟。Bolli等的研究表明感覺(jué)神經(jīng)參與心肌缺血時(shí)機(jī)體的保護(hù)過(guò)程。糖尿病患者由于神經(jīng)末梢受損，容易并發(fā)嚴(yán)重的心肌缺血。TRPV1受體是位于感覺(jué)神經(jīng)末梢上的感受器，在心臟有大量的表達(dá)。國(guó)內(nèi)王利宏等研究顯示糖尿病小鼠心臟上TRPV1受體及其神經(jīng)遞質(zhì)CGRP、SP的表達(dá)合成明顯減少，而Zhong?B等的研究表明激活TRPV1受體能改善小鼠心肌缺血再灌注后的心臟功能。

神經(jīng)生長(zhǎng)因子是一種多肽物質(zhì)，主要存在于交感神經(jīng)元及部分感覺(jué)神經(jīng)元所分布的靶區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞組織內(nèi)，其生物學(xué)活性主要是維持交感神經(jīng)和感覺(jué)神經(jīng)的功能。能誘導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)的合成，蛋白磷酸化、甲基化以及類似ras--蛋白的基因表達(dá)所需酶的合成，能有選擇地營(yíng)養(yǎng)交感神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的小纖維感覺(jué)神經(jīng)元，改善神經(jīng)末梢功能。是目前研究最為透徹的，具有神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)和促突起生長(zhǎng)雙重生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，它對(duì)中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長(zhǎng)、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用。

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，加上計(jì)算機(jī)技術(shù)的引入，使得目的基因的靶向?qū)胫委煶蔀榭赡?。本發(fā)明通過(guò)神經(jīng)生長(zhǎng)因子目的基因獲取、重組質(zhì)粒的構(gòu)建及陽(yáng)性克隆測(cè)序，成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)腺病毒載體，并通過(guò)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后免疫熒光觀察及免疫印跡（Western?Blot）檢測(cè)，及重組腺病毒滴度測(cè)定，得到了合適滴度的有表達(dá)功能的重組腺病毒載體。

發(fā)明內(nèi)容??

本發(fā)明的目的是提供表達(dá)小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的重組腺病毒載體的構(gòu)建，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)：

（1）重組質(zhì)粒的構(gòu)建

查詢美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心獲得小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF?的基因序列，序列號(hào)NM_001112698，（編碼序列SEQ?ID?NO:1），獲取cDNA模板及引物。PCR法擴(kuò)增目的基因:神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)有無(wú)目的基因。從上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司處購(gòu)得腺病毒載體（GV135），將腺病毒載體(GV135)用限制性內(nèi)切酶AgeI酶切（酶切位點(diǎn)為5＇A＾CCGGT3＇），獲得線性化表達(dá)載體。通過(guò)引物1?GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTCCATGTTGTTCTACACTC?和引物2?TCACCATGGTGGCGACCGGGCCTCTTCTTGTAGCCTTC，在PCR產(chǎn)物兩端引入GV135載體的一段交換臂，由于重組酶的作用PCR產(chǎn)物和載體在交換臂處進(jìn)行交換連接，連接后，以氯化鈣沉淀法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，接種于含有氨芐抗性的瓊脂平皿，挑選陽(yáng)性菌落，用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。而后1.2%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定陽(yáng)性克隆，并對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

（2）重組腺病毒的包裝產(chǎn)生

將購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司的293T細(xì)胞接種于培養(yǎng)板內(nèi)，每60mm的培養(yǎng)板中接種7–8?×?10⁵個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)70%時(shí)轉(zhuǎn)染。取5μg上述已制備的過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒，加入25μl的CaCl₂?、250μl的N,N-二(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸BES緩沖液，混勻后室溫孵育10分鐘，逐滴加入60mm的培養(yǎng)板中，混勻后將培養(yǎng)板放入37℃?5%CO₂的孵箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染8天后，觀察到大部分細(xì)胞浮起，細(xì)胞變大變圓，胞核增大，即進(jìn)行細(xì)胞收集。產(chǎn)生重組腺病毒載體，其編碼序列為SEQ?ID?NO:2。

所述PCR法中使用了兩種引物，

PCR引物1:?GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTCCATGTTGTTCTACACTC?，引物2:?TCACCATGGTGGCGACCGGGCCTCTTCTTGTAGCCTTC，引物3：GGTATAAGAGGCGCGACCAG，引物4：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG，其中引物1和引物2作為目的基因NGF的反應(yīng)引物，引物3和引物4作為重組克隆的PCR鑒定引物。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述的載體的表達(dá)方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)：