[發明專利]表達小鼠神經生長因子的重組腺病毒及其制備方法

有效

• 申請號: 201210329633.8
• 申請日: 2012-09-09
• 公開（公告）號: CN102827875A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 鄭良榮;韓杰;張媛媛;孫澤瑋;王利宏
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/66;A61K48/00;A61P3/10;A61P9/10
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

1.一種表達小鼠神經生長因子的重組腺病毒載體的構建方法，其特征在于，通過以下步驟實現：

（1）重組質粒的構建

從美國國立生物技術信息中心獲得小鼠神經生長因子的基因序列，序列號NM_001112698，獲取cDNA模板及引物，PCR法擴增目的基因:神經生長因子，PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測有無目的基因，將腺病毒載體(GV135)用限制性內切酶AgeI酶切，酶切位點為5＇A＾CCGGT3＇，獲得線性化表達載體，通過引物1?GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTCCATGTTGTTCTACACTC?和引物2?TCACCATGGTGGCGACCGGGCCTCTTCTTGTAGCCTTC，在PCR產物兩端引入GV135載體的一段交換臂，由于重組酶的作用PCR產物和載體在交換臂處進行交換連接，連接后，以氯化鈣沉淀法轉化大腸桿菌DH5α，接種于含有氨芐抗性的瓊脂平皿，挑選陽性菌落，用小量質粒提取試劑盒提取質粒，而后1.2%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定陽性克隆，并對陽性質粒進行測序；

（2）重組腺病毒的包裝產生

將購于上海吉凱基因化學技術有限公司的293T細胞接種于培養板內，每60mm的培養板中接種7–8?×?10⁵個細胞，培養至細胞密度達70%時轉染，取5μg上述已制備的過表達重組質粒，加入25μl的CaCl₂、250μl的N,N-二(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸BES緩沖液，混勻后室溫孵育10分鐘，逐滴加入60mm的培養板中，混勻后將培養板放入37℃?5%CO₂的孵箱中培養，轉染8天后，觀察到大部分細胞浮起，細胞變大變圓，胞核增大，即進行細胞收集，產生重組腺病毒載體，其編碼序列為SEQ?ID?NO:2。

2.根據權利要求1所述的一種表達小鼠神經生長因子的重組腺病毒載體的構建方法，其特征在于，所述PCR法中使用的引物1:?GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTCCATGTTGTTCTACACTC?，引物2:?TCACCATGGTGGCGACCGGGCCTCTTCTTGTAGCCTTC，引物3：GGTATAAGAGGCGCGACCAG，引物4：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG，其中引物1和引物2作為目的基因小鼠神經生長因子的反應引物，引物3和引物4作為重組克隆的PCR鑒定引物。