[發明專利]焦磷酸測序法檢測FGFR2基因多態性試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201210329118.X
• 申請日: 2012-09-07
• 公開（公告）號: CN102899404A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 曹杉;周宏灝
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 盧宏

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體的是涉及焦磷酸測序法檢測FGFR2基因多態性的試劑盒及方法。?

背景技術

乳腺癌(Breast?Cancer)是來自乳腺終末導管小葉上皮的惡性腫瘤。發病率在過去50年中呈緩慢上升趨勢，已躍居女性惡性腫瘤第一位。乳腺癌常發與于40~60歲的婦女，小于35歲得女性較少發病。男性乳腺癌罕見，約占全部乳腺癌的1%左右。乳腺癌多數發生于乳腺外上象限，其次為乳腺中央區和其他象限。乳腺癌的發病機制尚未完全闡明，雌激素長期作用、家族遺傳傾向，環境因素和長時間大劑量接觸放射線和乳腺癌發病有關。約5~10%的乳腺癌患者有家族遺傳傾向。FGFR2是成纖維細胞因子受體家族中的一員，研究發現該基因突變與患乳腺癌易感性顯著相關?(Nature.?2007;?447(28):?1087-93)?。?

FGFR2基因在?rs2981582位點突變后，雜合突變（GA）導致一二三級患乳腺癌的風險比野生型（GG）分別增加32%、31%和12%，純合突變（AA）導致一二三級患乳腺癌的風險比野生型（GG）分別增加83%、68%和32%?(Plos?Genet.?2008.?4(4):?e1000054)?。?

FGFR2基因突變導致乳腺癌發病風險增加，該基因位點的突變檢測對乳腺癌的預防，早期診斷和治療具有重要意義。有乳腺癌、卵巢癌或其它癌癥家族史的人群，有乳腺癌良性腫瘤病史者，未生育或35歲以后才生育的人群，月經初潮早，絕經較晚，經期長者，經常攝取高脂肪或高動物性脂肪、愛吃熟牛肉的人群，經常口服避孕藥的人群，經常接觸各種化學致癌劑、接受各種物理輻射、大量食用腌制食品以及吸煙、酗酒的人群，轉移癌癥至乳房者，不常運動或易患病人群更應該及早的進行該基因的檢測。對于FGFR2基因檢測高患病風險的人群，應該在飲食、生活、運動、保健、健康體檢等方面進行科學合理的安排，以達到降低乳腺癌患病風險。?

綜上，FGFR2基因多態性對乳腺癌疾病的風險評估，尤其是一些特殊人群患病的預測，具有重要的臨床意義。開發快速、高效、準確、便捷、經濟的檢測FGFR2基因多態性檢測試劑盒將為乳腺癌的發生起到預測、預防作用。?

焦磷酸測序(Pyro?sequencing)技術是新一代DNA序列分析技術，該技術無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，是一種通用型技術平臺。該技術具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準確、高通量等特點，符合臨床大樣本檢測要求。?

發明內容

本發明旨在提供一種焦磷酸測序法檢測FGFR2基因（SEQ?ID?NO.1）多態性的試劑盒及方法，以實現快速、簡便、準確、高效、實用、經濟的檢測FGFR2?SNP。?

為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：?

一種焦磷酸測序法檢測FGFR2基因多態性的試劑盒，包括如下引物：

（1）擴增引物：

?????上游引物：5’-GAATAAAACGGCAGATCCCA-3’（SEQ?ID?NO.2）；

?????下游引物：5’-ACGAGATGTGTTCCCAGAGC-3’（SEQ?ID?NO.3）；

?????其中，下游引物的5’進行生物素標記；

（2）測序引物：5’-GCCACTTAATGAACCTGT-3’（SEQ?ID?NO.4）；

試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規試劑。

一種應用上述試劑盒檢測FGFR2基因多態性的方法，包括如下步驟：?

（1）DNA提取；

（2）聚合酶鏈反應：

配制50μl?PCR擴增體系，包含：10×PCR?buffer?5.0μl，?dNTP?1.5μl，?FGFR2-上游引物?0.5μl，?FGFR2?(RS2981582)下游引物0.5μl，?rTaq0.5μl，水41.0μl，模板1.0μl；循環程序為：95^?oC?5min預變性；依次在95^oC?30S，50^oC?30S，72^oC?30S，進行40個循環；72^oC?保持5min，最終保持在4^?oC，得擴增產物；

（3）焦磷酸測序單鏈樣本純化；