[發(fā)明專利]胃腸腫瘤發(fā)病相關(guān)抑癌基因表觀突變檢測(cè)試劑盒及其用途

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210328782.2
• 申請(qǐng)日: 2012-09-06
• 公開（公告）號(hào): CN102787174A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范怡梅;李小薇;楊文杰;王敏;陳小鳳;吳曉梅;韓嘯;丁培成;楊白冰;王亞平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 南京知識(shí)律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種胃腸腫瘤發(fā)病相關(guān)抑癌基因表觀突變檢測(cè)試劑盒，特別涉及其在中國(guó)胃腸腫瘤患病人群的表觀突變分析與后果評(píng)估。

背景技術(shù)

作為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要標(biāo)志之一，腫瘤等復(fù)雜性疾病的遺傳分析和基因診斷正不斷走向臨床，并逐步成為臨床醫(yī)學(xué)的一種常規(guī)手段。在人類腫瘤的發(fā)展中，基因結(jié)構(gòu)性變異與表觀遺傳學(xué)改變?cè)诳蛇z傳的基因表達(dá)變異中均起著重要作用。已經(jīng)知道，抑癌基因的表觀遺傳學(xué)改變，特別是基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高度甲基化，可以導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄沉默，從而丟失相應(yīng)蛋白的表達(dá)及功能，引發(fā)腫瘤。此機(jī)制在腫瘤的形成過程中越來越受到重視。

胃腸腫瘤包括胃癌與結(jié)直腸癌，是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤，在我國(guó)約占惡性腫瘤總發(fā)病率的1/4。研究表明一些抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化在胃腸腫瘤中頻繁出現(xiàn)，并且引起相應(yīng)蛋白的表達(dá)降低或丟失。其中以下9種基因的甲基化與胃腸腫瘤的關(guān)系尤其密切，它們分別是：維持DNA穩(wěn)定的錯(cuò)配修復(fù)基因MLH1及MSH2、能抑制IKKβ/NF-κB信號(hào)通路的脯氨酸羥化酶家族成員PHD3、衰老抑制基因Klotho、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白家族成員IGFBP7、Wnt信號(hào)通路競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑SFRP1、SFRP2及SFRP5，以及可抑制細(xì)胞增殖的細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子家族成員P16^INK4a。因此有必要開發(fā)一種方便快捷的胃腸腫瘤發(fā)病相關(guān)抑癌基因表觀突變檢測(cè)試劑盒，以用于胃腸腫瘤的遺傳診斷。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種胃腸腫瘤發(fā)病相關(guān)抑癌基因表觀突變檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。

本檢測(cè)試劑盒主要包括以下成分：

(1)胃腸腫瘤發(fā)病相關(guān)的9種抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島擴(kuò)增與測(cè)序引物25對(duì)，各對(duì)引物序列見表1；

（2）PCR擴(kuò)增試劑，如dNTP、Ex?Taq?Hot?Start聚合酶等。

表1CpG島擴(kuò)增與測(cè)序引物序列

本試劑盒擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物可以采用以下三種方式進(jìn)行基因CpG島甲基化檢測(cè)：第一種方式是甲基化特異性PCR（methylation?specific?PCR,MSP)，第二種方式是亞硫酸氫鹽修飾和限制性內(nèi)切酶聯(lián)合分析（combinedbisulphite-restriction?analysis,COBRA）、第三種方式是亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序（bisulfite?sequencing?PCR,BSP）。因此，試劑盒中，還可以有亞硫酸氫鹽修飾試劑、限制性內(nèi)切酶或（/和）瓊脂糖凝膠。

所說的限制性內(nèi)切酶是BstUI酶。

本發(fā)明所說的試劑盒用于檢測(cè)胃腸腫瘤發(fā)病相關(guān)抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)。

本試劑盒的檢測(cè)基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化步驟包括：

（1）常規(guī)提取樣本組織DNA。

（2）DNA亞硫酸氫鹽修飾：按照CHEMICON公司CpGenome^TM?DNA修飾試劑盒說明書操作步驟，經(jīng)過磺化、水解脫氨和堿性條件下去磺化三個(gè)主要步驟，將非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。而5-甲基-胞嘧啶不能進(jìn)行該反應(yīng)。

（3）基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化分析，可以有三種分析方法：

I.甲基化特異性PCR（MSP)（適用于基因CpG島甲基化篩查）

實(shí)驗(yàn)原理：針對(duì)亞硫酸氫鹽修飾后的DNA序列差異設(shè)計(jì)引物。M引物在CpG二聯(lián)核苷處，設(shè)計(jì)為CG，只可以擴(kuò)出甲基化的DNA；U引物在CpG二聯(lián)核苷處，設(shè)計(jì)為TG，只可以擴(kuò)出非甲基化的DNA。用這種特異性擴(kuò)增的方法來檢測(cè)DNA中胞嘧啶的甲基化情況。

MSP法的具體步驟為：

A.PCR擴(kuò)增

引物如表1所示。反應(yīng)體系為25μl：TaKaRa?Ex?Taq?HS聚合酶0.125μl、10×EX?Taq?buffer2.5μl、dNTP?Mixture（2.5mM?each）2.5μl、上游引物（10μM）1μl、下游引物（10μM）1μl、亞硫酸氫鹽修飾DNA?1μl、ddH₂O?17μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30sec，60℃左右（相應(yīng)退火溫度）復(fù)性30sec，72℃延伸30sec，40個(gè)循環(huán)；再72℃延伸10min，4℃保存。

B.將PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，在紫外光下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

II.亞硫酸氫鹽修飾和限制性內(nèi)切酶聯(lián)合分析（COBRA）（適用于基因CpG島甲基化篩查）