[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)基因玉米Bt11液相芯片檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210328256.6
• 申請日: 2012-09-06
• 公開（公告）號: CN103667426A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓雪清;梅琳;王慧煜;林祥梅
• 申請（專利權(quán)）人: 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因玉米Bt11的檢測，具體地說，涉及一種轉(zhuǎn)基因玉米Bt11液相芯片檢測方法。?

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)基因玉米Bt11為兼具抗蟲害及耐除草劑兩種特性的品系，其轉(zhuǎn)入的抗蟲基因為Bt系列毒蛋白基因的Cry1Ab抗蟲基因，轉(zhuǎn)入的耐草丁膦除草劑基因是草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，在我國已批準進口用作加工原料，是轉(zhuǎn)基因玉米中的代表性品系。目前，一些國家要求檢測進口產(chǎn)品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，有的還要求查明來自哪個轉(zhuǎn)基因品系，該品系是否獲準進入本國，例如，中國、歐盟、日本、韓國等國家和組織要求對其進行標識。因此，針對性的檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系就顯得非常重要。目前，在基因水平上檢測轉(zhuǎn)基因作物的技術(shù)已有很多，如PCR、基因芯片（Microarrays）和Real-time?PCR等。這些檢測方法已經(jīng)在日常檢測工作中廣泛應(yīng)用。但由于轉(zhuǎn)基因作物的種類多、數(shù)量大，一些轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品經(jīng)過深加工、各種條件處理與保存后，轉(zhuǎn)基因成分部分或完全降解，所以檢測難度大。因此，需要建立更加特異和靈敏的高通量檢測方法。?

Luminex液相芯片檢測技術(shù)是一種全新的快速高通量檢測技術(shù)，也是唯一被美國食品與藥物管理局（FDA）批準用于臨床診斷的新型生物芯片產(chǎn)品。該技術(shù)集流式細胞技術(shù)、熒光編碼微球、激光、數(shù)字信號處理和傳統(tǒng)的生化技術(shù)于一體，具有獨特的優(yōu)點：檢測需要樣本少；相對于固相芯片，反應(yīng)在液態(tài)體系中進行，大大縮短檢測時間；關(guān)鍵是可靈活檢測上百種分子，滿足高通量檢測需要。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種新型、準確、特異性強，靈敏度高的轉(zhuǎn)基因玉米Bt11液相芯片檢測方法。?

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米Bt11的引物對和探針，所述引物對為：?

正向引物Bt11F：5’-TATCATCGACTTCCATGACCA-3’，?

反向引物Bt11R：Biotin-5’-AGCCAGTTACCTTCGGAAAA-3’；?

所述探針為Bt11Probe：?

NH₂-C₁₂-5’-TGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAG-3’。?

本發(fā)明還提供一種含有上述引物對和探針的用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米Bt11的試劑盒。?

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq?DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。更優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標準陽性模板。?

更優(yōu)選地，所述試劑盒還包括陽性驗證探針：Biotin-5’-CTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCA-3’。?

本發(fā)明進一步提供一種轉(zhuǎn)基因玉米Bt11液相芯片檢測方法，包括以下步驟：1）提取待測玉米的總DNA；2）以步驟1）中提取的DNA為模板，以上述Bt11F和Bt11R為引物，進行PCR擴增反應(yīng)；同時以水為模板設(shè)置空白對照；3）將PCR產(chǎn)物與包被有探針Bt11Probe的微球混合孵育，反應(yīng)結(jié)束后，置于液相芯片檢測儀上進行分析。若檢測的中位熒光值（MFI）大于空白對照的中位熒光值3倍以上，則判定該待測玉米為轉(zhuǎn)基因玉米Bt11品系。?

PCR反應(yīng)體系以50μL計為：?

PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；72℃延伸10min。?

前述的檢測方法，步驟3）中所述微球為羧基化熒光磁性微球。?

前述的檢測方法，步驟3）中混合孵育的條件為：95℃5min，58℃15min。?

本發(fā)明根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米Bt11中外源基因3’端與玉米基因組DNA連接區(qū)的序列，設(shè)計出可快速檢測轉(zhuǎn)基因玉米Bt11的特異性引物對和探針，并在此基礎(chǔ)上建立了液相芯片檢測方法，可快速、準確地檢測出轉(zhuǎn)基因玉米Bt11品系。根據(jù)該方法構(gòu)建的檢測試劑盒操作簡便，特異性好，靈敏度高，對邊境口岸的物種監(jiān)測具有重要意義。?

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例2中利用引物Bt11F和Bt11R進行PCR擴增的結(jié)果；其中，M為DNAMarker，1-10分別為：1、Bt?176玉米基因組；2、Bt11玉米基因組；3、NK603玉米基因組；4、MON810玉米基因組；5、非轉(zhuǎn)基因玉米基因組；6、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2基因組；7、非轉(zhuǎn)基因大豆基因組；8、轉(zhuǎn)基因棉花基因組；9、非轉(zhuǎn)基因棉花基因組；10、空白對照。?