[發明專利]轉基因玉米Bt11液相芯片檢測方法

有效

• 申請號: 201210328256.6
• 申請日: 2012-09-06
• 公開（公告）號: CN103667426A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 韓雪清;梅琳;王慧煜;林祥梅
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術領域

本發明涉及轉基因玉米Bt11的檢測，具體地說，涉及一種轉基因玉米Bt11液相芯片檢測方法。?

背景技術

轉基因玉米Bt11為兼具抗蟲害及耐除草劑兩種特性的品系，其轉入的抗蟲基因為Bt系列毒蛋白基因的Cry1Ab抗蟲基因，轉入的耐草丁膦除草劑基因是草丁膦乙酰轉移酶基因，在我國已批準進口用作加工原料，是轉基因玉米中的代表性品系。目前，一些國家要求檢測進口產品中是否含有轉基因成分，有的還要求查明來自哪個轉基因品系，該品系是否獲準進入本國，例如，中國、歐盟、日本、韓國等國家和組織要求對其進行標識。因此，針對性的檢測轉基因玉米品系就顯得非常重要。目前，在基因水平上檢測轉基因作物的技術已有很多，如PCR、基因芯片（Microarrays）和Real-time?PCR等。這些檢測方法已經在日常檢測工作中廣泛應用。但由于轉基因作物的種類多、數量大，一些轉基因產品經過深加工、各種條件處理與保存后，轉基因成分部分或完全降解，所以檢測難度大。因此，需要建立更加特異和靈敏的高通量檢測方法。?

Luminex液相芯片檢測技術是一種全新的快速高通量檢測技術，也是唯一被美國食品與藥物管理局（FDA）批準用于臨床診斷的新型生物芯片產品。該技術集流式細胞技術、熒光編碼微球、激光、數字信號處理和傳統的生化技術于一體，具有獨特的優點：檢測需要樣本少；相對于固相芯片，反應在液態體系中進行，大大縮短檢測時間；關鍵是可靈活檢測上百種分子，滿足高通量檢測需要。?

發明內容

本發明的目的是提供一種新型、準確、特異性強，靈敏度高的轉基因玉米Bt11液相芯片檢測方法。?

為了實現本發明目的，本發明提供一種用于檢測轉基因玉米Bt11的引物對和探針，所述引物對為：?

正向引物Bt11F：5’-TATCATCGACTTCCATGACCA-3’，?

反向引物Bt11R：Biotin-5’-AGCCAGTTACCTTCGGAAAA-3’；?

所述探針為Bt11Probe：?

NH₂-C₁₂-5’-TGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAG-3’。?

本發明還提供一種含有上述引物對和探針的用于檢測轉基因玉米Bt11的試劑盒。?

優選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq?DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應緩沖液中的一種或多種。更優選地，所述試劑盒還包括標準陽性模板。?

更優選地，所述試劑盒還包括陽性驗證探針：Biotin-5’-CTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCA-3’。?

本發明進一步提供一種轉基因玉米Bt11液相芯片檢測方法，包括以下步驟：1）提取待測玉米的總DNA；2）以步驟1）中提取的DNA為模板，以上述Bt11F和Bt11R為引物，進行PCR擴增反應；同時以水為模板設置空白對照；3）將PCR產物與包被有探針Bt11Probe的微球混合孵育，反應結束后，置于液相芯片檢測儀上進行分析。若檢測的中位熒光值（MFI）大于空白對照的中位熒光值3倍以上，則判定該待測玉米為轉基因玉米Bt11品系。?

PCR反應體系以50μL計為：?

PCR反應條件為：95℃預變性3min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環；72℃延伸10min。?

前述的檢測方法，步驟3）中所述微球為羧基化熒光磁性微球。?

前述的檢測方法，步驟3）中混合孵育的條件為：95℃5min，58℃15min。?

本發明根據轉基因玉米Bt11中外源基因3’端與玉米基因組DNA連接區的序列，設計出可快速檢測轉基因玉米Bt11的特異性引物對和探針，并在此基礎上建立了液相芯片檢測方法，可快速、準確地檢測出轉基因玉米Bt11品系。根據該方法構建的檢測試劑盒操作簡便，特異性好，靈敏度高，對邊境口岸的物種監測具有重要意義。?

附圖說明

圖1為本發明實施例2中利用引物Bt11F和Bt11R進行PCR擴增的結果；其中，M為DNAMarker，1-10分別為：1、Bt?176玉米基因組；2、Bt11玉米基因組；3、NK603玉米基因組；4、MON810玉米基因組；5、非轉基因玉米基因組；6、轉基因大豆GTS40-3-2基因組；7、非轉基因大豆基因組；8、轉基因棉花基因組；9、非轉基因棉花基因組；10、空白對照。?