[發明專利]一種檢測白血病相關融合基因的引物和探針、及其試劑盒

有效

• 申請號: 201210327547.3
• 申請日: 2012-09-06
• 公開（公告）號: CN102827937A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 熊慧;程新建;謝立群;陳嘉錚;包文靜;童光銓;陳偉
• 申請（專利權）人: 上海源奇生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
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技術領域

本發明涉及基因型的檢測，具體講，涉及一種檢測白血病相關融合基因的引物和探針、及其試劑盒。

背景技術

白血病(Leukemia)是造血系統的惡性腫瘤，其特征是骨髓、淋巴結等造血系統中一種或多種血細胞發生惡性增殖，并浸潤體內各組織臟器，導致正常造血組織細胞受抑制，產生各種癥狀。白血病臨床上常以發熱、出血、貧血，肝、脾、淋巴結腫大為特點。白血病一般按自然病程和細胞發育程度可分為急性白血病(AL)和慢性白血病(CL)，根據白血病細胞的形態和生化特征，又可分為急性淋巴細胞白血病(ALL)、急性非淋巴細胞白血病(ANLL)、慢性粒細胞白血病(CML)、慢性粒-單核細胞白血病(CMML)等。

白血病是國內十大高發惡性腫瘤之一，其發病率為2.76/10萬人口，我國估計有5萬以上患者，且白血病患者的數量正逐年增加。白血病的發病率雖然在腫瘤發病率中排第6位，但在兒童和青少年惡性腫瘤的發病率和死亡率中均占第1位。

近年臨床研究表明，大部分白血病和淋巴瘤存在某些染色體畸變，如易位、缺失、插入等。這些染色體易位畸變時大部分情況下會產生新的融合基因，這些融合基因可作為用于診斷不同類型白血病和淋巴瘤的分子標志。不同類型的白血病化療和放療的方案是不同的。所以，對這些分子標記進行檢測分析有利于治療方案的確定和分析預后。因此，世界衛生組織2000年發布的白血病和淋巴瘤診斷標準已將染色體易位后融合基因檢測作為最重要的指標之一。

BCR-ABL融合基因表達是各類白血病中研究的最為深入的部分，BCR-ABL和費城(Ph)染色體的形成相關，是白血病中最常見的染色體異常。約90％-95％的CML患者中可檢測到這種Ph染色體。Ph染色體形成的分子基礎是9號染色體上的c-ab1基因易位到22號染色體上的bcr基因上形成BCR-ABL融合基因，即t(9；22)(q34；q11)易位。臨床上把檢測Ph染色體作為CML分型診斷依據、療效評價，以及微小殘留病的檢測和預后評估的可靠指標。另外，值得一提的是，在CML中，還有一部分的Ph染色體陰性的CML患者，其BCR-ABL融合基因也為陽性，這可能是一部分的Ph染色體不易看清楚，據統計，在CML病人中，BCR-ABL融合基因的陽性率為99％，這也說明分子水平的檢測較細胞遺傳學的方法更為敏感。此外，在急性淋巴細胞性白血病中，也存在著t(9；22)(q34；q11)易位，形成BCR-ABL融合基因。

t(15；17)(q22；q12-21)易位見于10％-15％的ANLL中，可見于90％以上的APL中，成為APL的一個特異標志，易位產生PML-RARa融合基因。PML基因(早幼粒細胞白血病基因)位于15號染色體，全長50kb，其不同的結構域由不同的外顯子編碼，外顯子1編碼脯氨酸激活區，外顯子2編碼鋅指結構，外顯子3編碼與二聚體化相關的螺旋結構，外顯子4-6編碼a螺旋區。PML-RARa融合基因可以作為監測白血病微小殘留狀態的分子指標，對其進行檢測有助于進一步了解白血病患者緩解后體內白血病細胞的動力學特性，獲得一個從分子水平確定的完全緩解的新標準，從而能夠對臨床治療反應作出正確評價，及時調整治療方案，減輕患者的經濟負擔，同時減少不必要的化療所造成的痛苦。

t(8；21)(q22；q22)是AM中最常見的染色體易位，發生率可高達20％-40％，90％見于M2b型白血病中，易位導致AML1-ETO融合基因的產生。AML1-ETO融合基因陽性是預后良好的標志，其完全緩解(CR)率可達90％，5年長期無病生存可達50％-70％。采用染色體核型分析結果檢測該融合基因有時會得到矛盾的結果，對其進行熒光定量檢測可以對病人的病情進行分級，從而進行更為準確的預后判斷和復發檢測。

目前對白血病的檢查主要有，血象檢查，骨髓涂片檢查，血液生化檢查等，但這些都沒有對融合基因進行檢查，獲得的結果誤差范圍也比較大。目前檢測融合基因的方法主要包括熒光原位雜交技術(FISH)，PCR和基因芯片等。但這些方法存在著準確性差、操作復雜等缺陷，臨床應用困難。

為了幫助臨床醫生們準確及時檢測白血病融合基因、輔助確定相關化療方案及復發檢測，本發明從中國國情出發，開發了白血病相關融合基因檢測試劑盒，該試劑盒能定性檢測人骨髓標本中的白血病相關融合基因中BCR-ABL、AML1-ETO和PML-RARa的RNA量，從而指導白血病臨床診斷和用藥。

發明內容

本發明涉及一種檢測白血病相關融合基因的引物和探針、試劑盒。

為了完成本發明的目的，采用的技術方案為：