[發明專利]一種鹵醇脫鹵酶基因突變體及其應用

有效

• 申請號: 201210327418.4
• 申請日: 2012-09-06
• 公開（公告）號: CN102827853A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 陳峻青;蔡進;吉民;石進祥;石利平;尹曉龍
• 申請（專利權）人: 江蘇阿爾法藥業有限公司;東南大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/14;C12N15/63;C12N1/21;C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;傅婷婷

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種鹵醇脫鹵酶基因突變體及其應用。?

背景技術

阿托伐他汀鈣是立普妥（lipitor）的活性成分，立普妥是一種羥甲基戊二酰單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，可使體內膽固醇的合成減少，被用于治療高膽固醇血癥和混合型高脂血癥，冠心病和腦中風等疾病。?

阿托伐他汀鈣含兩個手性中心的側鏈是其藥效團，該側鏈的合成方法包括利用金屬催化劑從手性前體出發進行合成，或利用游離或固定化酶或含酶的完整細胞進行不對稱合成或外消旋拆分。由于生物法具有反應條件溫和、反應轉化率高、對映體選擇性高等多種優點，受到研究者的廣泛關注。鹵醇脫鹵酶（HHDH）是一類可以催化鄰鹵醇類化合物生成環氧化物的酶，因其能夠催化鄰鹵醇與環氧化合物之間的相互轉化，可用于合成多種化學中間體，并被用于阿托伐他汀鈣中間體的制備。1968年Castro首次在黃桿菌屬菌株(Flavobaterium?sp.)中發現了鹵醇脫鹵酶，此后，人們相繼篩選到了多種產鹵醇脫鹵酶的菌株，如發射形土壤桿菌（Agrobacterium?radiobacter）AD1，根癌土壤桿菌（Agrobacterium?tumefaciens），節桿菌（Arthrobacter?sp.）AD2，棒狀桿菌（Corynebacterium?sp.），分枝桿菌（Mycobacterium?sp.）GP1等。在已知的鹵醇脫鹵酶中，大部分已被克隆、測序及進行體外重組表達研究。目前對鹵醇脫鹵酶的研究集中于發現催化反應時間短、產物產率高、對映體選擇性高且副反應少的鹵醇脫鹵酶。?

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種鹵醇脫鹵酶基因突變體及其編碼的鹵醇脫鹵酶。?

本發明的另一目的是提供含有該鹵醇脫鹵酶基因突變體的重組載體。?

本發明的另一目的是提供含有該鹵醇脫鹵酶基因突變體的基因工程菌。?

本發明的又一目的是提供該該鹵醇脫鹵酶基因突變體的應用。?

本發明的目的可通過如下技術方案實現：?

一種鹵醇脫鹵酶基因突變體，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。?

本發明所述的鹵醇脫鹵酶基因突變體編碼的鹵醇脫鹵酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。?

一種含有本發明所述的鹵醇脫鹵酶基因突變體的重組載體。所述的重組載體其可通過本領域常規方法將本發明的鹵醇脫鹵酶基因的核苷酸序列連接于各種載體上構建而成。所述的載體可為本領域常規的各種載體，優選Puc18。?

含有本發明的鹵醇脫鹵酶基因突變體或其重組表達載體的基因工程菌。?

本發明基因工程菌優選大腸埃希氏菌（Escherichia?coli）BL21(DE3)或大腸埃希氏菌（Escherichia?coli）DH5α作為宿主細胞。將前述重組表達質粒轉化至大腸埃希氏菌（Escherichia?coli）中，即可得到本發明優選的基因工程菌。?

本發明所述的基因工程菌進一步優選大腸桿菌DH5αHhec05（Escherichia?coli?DH5αHhec05），已于2012年8月29日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC?NO：M?2012320。?

一種鹵醇脫鹵酶的制備方法，包括如下步驟：培養本發明所述的含有鹵醇脫鹵酶基因突變體的基因工程菌，獲得重組表達的鹵醇脫鹵酶。?

所述的培養包括藥搖培養或發酵培養；優選發酵培養。?

所述的發酵培養優選的發酵培養基的組成為：酵母提取物20g/L，甘油10g/L，NaCl?6g/L，磷酸氫二鉀4.2g/L，磷酸二氫鉀8.5g/L，硫酸銨0.5g/L，硫酸亞鐵1.0g/L，硫酸鋅七水合物0.5g/L，氯化鈣二水合物0.06g/L，硫酸錳二水合物0.2g/L，硫酸銅七水合物0.6g/L，氯化鈷六水合物0.9g/L。?

所述的發酵培養優選的生產罐發酵條件是：罐溫37℃，攪拌轉速900rpm左右，發酵過程中控制DO?30%以上，空氣流量1:1.5vvm，甘油殘余量1%以下。?

發酵過程采用常規的兩階段控制策略：發酵前期即菌體生長階段，控制發酵液pH?6.8左右，罐溫35-37℃；發酵后期即添加IPTG之后的鹵醇脫鹵酶誘導表達階段，控制發酵液pH?7.0左右，罐溫為28-30℃。以使發酵前期菌體大量繁殖，發酵后期鹵醇脫鹵酶大量表達。?