[發明專利]一種鹵醇脫鹵酶基因突變體及其應用

有效

• 申請號: 201210327418.4
• 申請日: 2012-09-06
• 公開（公告）號: CN102827853A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 陳峻青;蔡進;吉民;石進祥;石利平;尹曉龍
• 申請（專利權）人: 江蘇阿爾法藥業有限公司;東南大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/14;C12N15/63;C12N1/21;C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;傅婷婷

1.一種鹵醇脫鹵酶基因突變體，其特征在于核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.權利要求1所述的鹵醇脫鹵酶基因突變體編碼的鹵醇脫鹵酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

3.一種含有權利要求1所述的鹵醇脫鹵酶基因突變體的重組載體。

4.含有權利要求1所述的鹵醇脫鹵酶基因突變體或權利要求3所述的重組載體的基因工程菌。

5.根據權利要求4所述的基因工程菌，其特征在于宿主細胞為大腸埃希氏菌。

6.根據權利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述的基因工程菌命名為E.ColiDH5αHhec05，已于2012年8月29日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC?NO：M?2012320。

7.一種鹵醇脫鹵酶的制備方法，其特征在于包括如下步驟：培養權利要求4～6中任一項所述的基因工程菌，獲得重組表達的鹵醇脫鹵酶。

8.根據權利要求7所述的鹵醇脫鹵酶的制備方法，其特征在于所述的培養包括藥搖培養或發酵培養；優選發酵培養；所述的發酵培養優選的發酵培養基的組成為：酵母提取物20g/L，甘油10g/L，NaCl?6g/L，磷酸氫二鉀4.2g/L，磷酸二氫鉀8.5g/L，硫酸銨0.5g/L，硫酸亞鐵1.0g/L，硫酸鋅七水合物0.5g/L，氯化鈣二水合物0.06g/L，硫酸錳二水合物02g/L，硫酸銅七水合物0.6g/L，氯化鈷六水合物0.9g/L；所述的發酵培養優選的生產罐發酵條件是：罐溫37℃，攪拌轉速800～1500rpm，發酵過程中控制DO?30%以上，空氣流量1:1.5vvm，甘油殘余量1%以下。

9.根據權利要求8所述的鹵醇脫鹵酶的制備方法，其特征在于所述的發酵采用兩階段控制策略：發酵前期即菌體生長階段，控制發酵液pH?6.0-7.0，罐溫35-37℃；發酵后期即添加IPTG之后的鹵醇脫鹵酶誘導表達階段，控制發酵液pH?6.5-7.5，罐溫為28-30℃。

10.權利要求1所述的鹵醇脫鹵酶基因突變體在鄰鹵醇化合物脫鹵素反應中的應用，其特征在于利用權利要求1所述的鹵醇脫鹵酶基因突變體構建基因工程菌，并表達制備鹵醇脫鹵酶，以所述的鹵醇脫鹵酶為催化劑催化鄰鹵醇化合物脫鹵素反應。

11.根據權利要求10所述的應用，其特征在于：所述的鄰鹵醇化合物脫鹵素反應的底物的結構式為

其中，X為鹵素；?

R為烷基，苯基或帶有取代基的苯基。?