[發明專利]一種木爾坦棉花曲葉病毒侵染性載體構建方法

無效

• 申請號: 201210326777.8
• 申請日: 2012-09-06
• 公開（公告）號: CN102816791A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發明（設計）人: 周雪平;顧周杭;謝艷;胡高潔
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/66;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

技術領域

本發明涉及基因工程領域，尤其涉及棉花DNA病毒侵染性載體構建方法。?

背景技術

棉花曲葉病（Cotton?leaf?curl?disease）?是一種在印度半島地區嚴重危害棉花生產的病害。棉花曲葉病主要由雙生病毒引起，經煙粉虱傳播，典型的癥狀是植株葉片向上或向下卷曲、葉脈顏色加深、葉背面葉脈膨大和耳突增生，形成杯狀側葉，植株矮化，棉纖維低產，棉鈴少結或不結，可造成嚴重減產，甚至絕收。木爾坦棉花曲葉病毒（Cotton?leaf?curl?Multan?virus,?CLCuMV）是引起棉花曲葉病的主要病原。木爾坦棉花曲葉病毒屬雙生病毒科（Geminiviridae）中的菜豆金黃花葉病毒屬（Begomovirus），具有典型的雙聯體顆粒形態，大小約18～20?nm×30?nm，基因組含有DNA?A和衛星DNAβ分子，并形成CLCuMV/DNAβ病害復合體。CLCuMV?DNA?A編碼AV2，AV1，AC3，AC2，AC1，AC4共6個蛋白，分別是外殼前體蛋白，外殼蛋白，復制增強蛋白，轉錄激活蛋白，復制蛋白和轉錄調控蛋白。衛星DNAβ基因組大小是DNA?A分子的一半，與DNA?A沒有序列同源性，DNAβ分子只編碼一個致病因子βC1。DNA?A和DNAβ在寄主體內是一種互補的關系，DNA?A能夠系統侵染植株，但是單獨不能引發典型的癥狀，只有當DNAβ存在時，植株才能引發典型的病毒病癥狀，并且DNAβ能夠大大促進DNA?A在植株中的積累量，而DNAβ不能獨立復制，它必須依賴于DNA?A進行復制、移動及介體傳播。?

雙生病毒正在全球范圍內日益猖撅危害，已有40多個國家的棉花、番茄、木薯和煙草等作物遭受此類病毒的毀滅性危害。尤其是雙生病毒DNA與衛星DNAβ形成的病害復合體正在快速擴展它的地理分布和寄主范圍。我國也已在云南、廣西、廣東、福建、海南、北京、上海等17個省市的煙草、番茄、番木瓜和南瓜等作物以及假馬鞭、勝紅薊、稀鹼等雜草上發現了40多種雙生病毒，且多數為雙生病毒DNA與衛星DNAβ形成的病害復合體，并呈擴展蔓延的趨勢。這一病害復合體在全球范圍廣泛存在并逐年加重，其地理分布和寄主范圍迅速擴展，且近年來粉虱介體在全球范圍內的大爆發，加上生產上單一品種的大規模種植，這類病害復合體一旦傳入新的地區，將會給當地農業生態系統帶來巨大的威脅。?

CLCuMV是在廣東地區表現為曲葉癥狀的扶桑上分離得到的，其病毒全長基因組序列與木爾坦棉花曲葉病毒Nanning、G6和Okra06分離物的同源性達到99％以上。CLCuMV是不能機械傳播的雙生病毒，為了明確CLCuMV和衛星DNAβ在致病中的作用，以及研究CLCuMV基因組功能，必須構建CLCuMV的侵染性克隆。目前，利用植物病毒接種植物的方法主要有三種。第一是利用機械摩擦的方法，該方法只適用于可以機械傳播侵染的植物病毒，如煙草花葉病毒和黃瓜花葉病毒，而絕大多數雙生病毒因不能機械傳播因而無法應用該方法侵染植物。第二種是基因槍轟擊的方法，該方法操作簡便，但效率低，且整套設備與金粉等耗材價格昂貴，不便于推廣。最后一種是基于農桿菌介導的方法。該方法首先在dsDNA病毒中的花椰菜花葉病毒中成功應用，并逐漸被應用于雙生病毒，它是一種簡易，有效的方法。本發明是以木爾坦棉花曲葉病毒為材料來建立侵染性載體構建的方法。?

發明內容

本發明的目的是提供一種木爾坦棉花曲葉病毒侵染性載體的構建方法，包括如下步驟：?

1）從采集的感染木爾坦棉花曲葉病毒的棉花中提取植物基因組總DNA；

2）以該植物基因組總DNA為模板，設計病毒全長特異引物GXA?sal1?F：5’-?GGTCGACGTCATCAATGACGTTGTA-3和?GXA?sal1?R：5’-ACGTCGACCCGCATTTCCTCAAA-3’對木爾坦棉花曲葉病毒的DNA?A進行PCR擴增，擴增產物克隆至T-Vector；同時，設計衛星DNAβ特異引物beta01：5'-GGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC-3'和beta02：5'-GGTACCTACCCTCCCAGGGGTACAC-3'對木爾坦棉花曲葉病毒的衛星DNAβ分子進行PCR擴增，擴增產物克隆至T-Vector；

3）對克隆產物進行陽性克隆的篩選并進行DNA序列測定；

4）DNA序列測定結果通過DNAStar分析軟件進行組合、拼接，獲得木爾坦棉花曲葉病毒的DNA?A組份和木爾坦棉花曲葉病毒的DNAβ的全長基因組序列；