[發明專利]一種木爾坦棉花曲葉病毒侵染性載體構建方法

無效

• 申請號: 201210326777.8
• 申請日: 2012-09-06
• 公開（公告）號: CN102816791A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發明（設計）人: 周雪平;顧周杭;謝艷;胡高潔
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/66;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

1.一種木爾坦棉花曲葉病毒侵染性載體的構建方法，其特征在于包括如下步驟：

1）從采集的感染木爾坦棉花曲葉病毒的棉花中提取植物基因組總DNA；

2）以該植物基因組總DNA為模板，設計病毒全長特異引物GXA?sal1?F：5’-?GGTCGACGTCATCAATGACGTTGTA-3和?GXA?sal1?R：5’-ACGTCGACCCGCATTTCCTCAAA-3’對木爾坦棉花曲葉病毒的DNA?A進行PCR擴增，擴增產物克隆至T-Vector；同時，設計衛星DNAβ特異引物beta01：5'-GGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC-3'和beta02：5'-GGTACCTACCCTCCCAGGGGTACAC-3'對木爾坦棉花曲葉病毒的衛星DNAβ分子進行PCR擴增，擴增產物克隆至T-Vector；

3）對克隆產物進行陽性克隆的篩選并進行DNA序列測定；

4）DNA序列測定結果通過DNAStar分析軟件進行組合、拼接，獲得木爾坦棉花曲葉病毒的DNA?A組份和木爾坦棉花曲葉病毒的DNAβ的全長基因組序列；

5）木爾坦棉花曲葉病毒侵染性載體構建：在測序結果基礎上，利用分子生物學方法把木爾坦棉花曲葉病毒的DNA?A組份的1.9個正向重復的基因組構建到改良型植物表達載體pCambia2300上，獲得帶有DNA?A組份的重組植物表達載體pCambia-1.9A,?并將其導入到大腸桿菌；利用限制性酶切的方法把1.8個正向重復的木爾坦棉花曲葉病毒的DNAβ構建到改良型植物表達載體pCambia2300上，獲得帶有DNAβ的重組植物表達載體pCambia-1.8β,?并將其導入到大腸桿菌；

或在測序結果基礎上，利用分子生物學方法把木爾坦棉花曲葉病毒的DNA?A組份的1.9個正向重復和木爾坦棉花曲葉病毒的衛星DNAβ的1.8個正向重復構建到同一個改良型植物表達載體pCambia2300上，獲得帶有木爾坦棉花曲葉病毒的DNA?A和衛星DNAβ的重組植物表達載體pCambia-1.9A-1.8β,?并將其導入到大腸桿菌；

6）通過電擊的方法將上述重組植物表達載體pCambia-1.9A、pCambia-1.8β或pCambia-1.9A-1.8β分別導入農桿菌菌株EHA105；

7）接種前的菌液處理：上述3種帶有木爾坦棉花曲葉病毒重組植物表達載體的農桿菌分別接種20?mL?YEP雙抗液體培養基，28℃?220rpm搖菌培養至OD600為0.8-1.2；經12000?rpm?1分鐘離心，棄上清，用含10?mM?MgCl₂，10?mM?MES，200?mM?乙酰丁香酮的浸潤緩沖液重新懸浮菌體，調整OD600為1.0左右，靜置2-3小時后浸潤植物備用；

8）浸潤接種：選用4-6葉充分展開的苗齡期的植株，利用不帶針頭的1?ml注射器在?3-4周的植物葉片背面進行浸潤一株植物一般接種3-4片葉子；侵染性測定時；?

9）接種植株置于25℃隔離溫室培養，10天后觀察接種植株的癥狀，對有癥狀和沒有癥狀的接種植株進行PCR和Southern?blot檢測以鑒定其侵染性及病毒積累量。

2.一種如權利要求1所述的農桿菌介導的木爾坦棉花曲葉病毒侵染性克隆的應用，其特征在于用于木爾坦棉花曲葉病毒的致病性測定、病毒基因功能研究、棉花抗性品種的鑒定和培育或寄主植物、傳毒介體與病毒三者之間的互作研究。