[發(fā)明專利]病原微生物核酸無擴增檢測與分型方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210326601.2
• 申請日: 2012-08-30
• 公開（公告）號: CN102978295A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 羅陽;張波;蔣天倫;府偉靈;劉煒
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶西南醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，尤其涉及一種病原微生物核酸無擴增直接檢測與分型方法及試劑盒。

背景技術(shù)

感染性疾病是嚴(yán)重危害人類健康的最重要疾病之一。據(jù)國家疾控中心(CDC)統(tǒng)計：2011年我國法定傳染病發(fā)病632萬例，死亡1.5萬人。其中病毒性肝炎、肺結(jié)核和梅毒的發(fā)病率位居前三位，占乙類傳染病發(fā)病總數(shù)的85.41％。且乙型肝炎、丙型肝炎等血源性傳染病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。上述數(shù)據(jù)表明，乙型病毒性肝炎仍占據(jù)我國感染性疾病發(fā)病率首位，其發(fā)病人數(shù)亦占我國肝炎發(fā)病總?cè)藬?shù)的70％以上。大量臨床資料和研究表明，乙型病毒性肝炎患者的血清學(xué)轉(zhuǎn)歸和預(yù)后與所感染乙型肝炎病毒(HBV)的基因型及拷貝數(shù)密切相關(guān)。因此，建立快速、準(zhǔn)確的HBV檢測與分型方法對于乙型病毒性肝炎的早期診斷、療效監(jiān)測、預(yù)后判斷和個體化治療具有重要臨床意義。

對于HBV感染的檢測，目前的實驗室方法主要分為直接檢測和間接檢測兩大類。其中間接檢測以生物化學(xué)方法和免疫學(xué)為主。生物化學(xué)方法通過檢測多項轉(zhuǎn)氨酶(ALT，AST，γ-GGT等)的升高來間接判斷病毒感染，其靈敏度較高，但易受其它原因?qū)е碌母螕p傷影響，故特異性差。免疫法包括早期的ELISA和逐漸發(fā)展形成的免疫散射比濁、化學(xué)發(fā)光和時間分辨熒光檢測等技術(shù)。其原理是通過同時檢測多項HBV特征性抗原(HBsAg、HBcAg、HBeAg)和患者機體產(chǎn)生的相應(yīng)抗體(HBsAb、HBcAb)來進行綜合判定。該方法簡便易行，在臨床上廣為應(yīng)用。但是免疫學(xué)方法無法檢出處于“窗口期”的HBV感染，易導(dǎo)致假陰性。最重要的是，所有間接檢測方法都無法對HBV進行基因型分型，因而無法指導(dǎo)個體化臨床用藥。

直接檢測法則檢測患者樣本中的HBV的數(shù)量和基因亞型，具有早期、實時、動態(tài)監(jiān)測HBV拷貝數(shù)變化的特點，在早期診斷、療效判斷、個體治療等方面具有無可比擬的優(yōu)勢。因病毒在體外極難培養(yǎng)，因此目前病毒直接檢測技術(shù)均通過檢測HBV核酸實現(xiàn)。然而，由于早期HBV感染患者體內(nèi)的HBV拷貝數(shù)較低(通常10⁴-10⁶/ml)，不足以被核酸雜交等常規(guī)分子生物學(xué)方法直接檢出。因此進行靶分子信號放大是實現(xiàn)HBV?DNA高分辨檢測與分型的前提。目前的信號放大策略主要包括兩類：DNA模板擴增技術(shù)(前放大)和檢測信號放大技術(shù)(后放大)。其中DNA模板擴增技術(shù)以PCR為基礎(chǔ)，通過體外擴增核酸分子模板至10⁹倍，以實現(xiàn)信號放大。PCR技術(shù)相繼衍生出一系列變溫核酸擴增、檢測技術(shù)，如巣式PCR，熒光定量PCR和多重PCR等。這些基于PCR的擴增技術(shù)用于HBV檢測與分型尚存在以下不足：(1)對擴增條件要求極為嚴(yán)格，極易產(chǎn)生假陽性或者假陰性。(2)多基因型同步擴增時常導(dǎo)致高濃度模板對低濃度模板的競爭抑制，導(dǎo)致低濃度樣本的假陰性結(jié)果。(3)PCR相關(guān)技術(shù)核心知識產(chǎn)權(quán)的壁壘導(dǎo)致了其相關(guān)試劑和設(shè)備價格昂貴，增加了醫(yī)療成本和患者負擔(dān)。近年來，相繼發(fā)展出一系列等溫擴增技術(shù)，如鏈置換擴增(SDA)，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)，滾環(huán)擴增(RCA)等技術(shù)，部分降低了醫(yī)療成本和解決了上述低濃度模板擴增受抑制等不足。然而這些技術(shù)仍然無法解決同步進行HBV高分辨檢測和基因分型的難題。

相對于DNA模板擴增技術(shù)而言，檢測信號放大(后放大)技術(shù)僅對已檢測到的低信號進行放大，可消除因不同濃度模板擴增導(dǎo)致的擴增性抑制。由于檢測信號放大技術(shù)是與檢測原理緊密聯(lián)系的，因此每個檢測技術(shù)平臺都有自己最適合的信號放大技術(shù)。如：基于石英晶體微天平(QCM)傳感器的質(zhì)量放大，基于表面等離子體(SPR)傳感器的折射光角度放大，基于電化學(xué)傳感器的酶學(xué)放大，基于熒光檢測的納米傳感器的熒光增強等。在這些檢測平臺中，均需使用生物傳感技術(shù)將低于檢測限的微弱信號轉(zhuǎn)化為可以識別的物理或者化學(xué)信號。以前使用最多的是酶化學(xué)傳感器，其原理是通過酶的催化或者與底物的結(jié)合進行信號放大。近年來，納米材料合成、表面修飾技術(shù)的飛速發(fā)展為信號放大技術(shù)的研發(fā)提供了廣闊空間。發(fā)明人前期在納米材料信號放大方面進行了大量研究，成功將納米金顆粒用于QCM傳感器的信號放大，實現(xiàn)了血液中低濃度金黃色葡萄球菌的檢測；同時也實現(xiàn)了HCR反應(yīng)的無酶熒光信號放大。然而，試驗中我們發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)熒光染料極易被漂白，用于臨床樣本檢測難度較大。