[發明專利]病原微生物核酸無擴增檢測與分型方法

有效

• 申請號: 201210326601.2
• 申請日: 2012-08-30
• 公開（公告）號: CN102978295A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 羅陽;張波;蔣天倫;府偉靈;劉煒
• 申請（專利權）人: 重慶西南醫院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種病原微生物核酸無擴增檢測和分型方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)根據待測樣品的核酸序列合成DNA和/或PNA探針1，2，3，所述的探針1，2，3能夠分別與待測樣品雜交并且互不重疊；

(2)分別將探針1，2，3與磁性納米顆粒和兩種熒光量子點耦聯，所述的熒光量子點的熒光可以相同，也可以不相同。

(3)合成生物素連接的橋連DNA合/或PNA序列1，2以及互補的序列1’，2’，將序列1’和2’與步驟(2)中的兩種熒光量子點分別耦聯；

(4)合成兩種生物素修飾的熒光顏色不同的兩種熒光量子點，這兩種熒光量子點可以與步驟(2)中的熒光量子點相同，也可以不同；

(5)選擇步驟(2)中的探針修飾的磁性納米顆粒和其中一種探針修飾的熒光量子點，將其與待測樣品以及相應的橋連序列進行雜交并進行磁性分離；然后通過重復加入Sa(鏈霉親和素)-洗滌-加入步驟(4)中的其中一種生物素修飾的熒光量子點-洗滌的步驟進行層層組裝，然后通過磁性分離得到待測樣品的富集物，任選地，對富集物的樣品進行熒光強度測定；

(6)選擇另外一種探針修飾的熒光量子點，將其與步驟(5)獲得的富集物以及相應的橋連序列進行雜交并進行磁性分離；然后通過重復加入Sa-洗滌-加入步驟(4)中的另外一種生物素修飾的熒光量子點-洗滌的步驟進行層層組裝，然后通過磁性分離得到待測樣品的第二富集物，任選地，對第二富集物的樣品運用熒光光譜成像技術或者流式細胞儀技術進行檢測。

2.一種病原微生物核酸無擴增檢測和分型的試劑盒，其特征在于包括：三種DNA和/或PNA探針耦聯的磁性納米顆粒和兩種熒光量子點，所述的三種探針能夠分別與待測樣品雜交并且互不重疊，熒光量子點的熒光可以相?同，也可以不相同；生物素修飾的橋連DNA和/或PNA，橋連DNA和/或PNA的互補序列耦聯的兩種熒光量子點；生物素修飾的熒光顏色不同的兩種熒光量子點，這兩種熒光量子點可以與上述熒光量子點的熒光相同，也可以不同；SA以及緩沖溶液。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于待測樣品為HBV核酸。

4.根據權利要求1所述的方法或權利要求2所述的試劑盒，所述的探針為PNA，所述的熒光量子點中的一個或多個或全部為CdSe/ZnS量子點，優選的，兩種不同的熒光量子點的發射波長相差至少30nm，優選至少50nm，進一步優選至少80nm。

5.根據權利要求1所述的方法或權利要求2所述的試劑盒，所述的磁性納米顆粒是?納米顆粒。

6.根據權利要求1所述的方法或權利要求2所述的試劑盒，所述的三種探針為PNA，其中兩個種屬特異性探針序列為PNA種屬特異性探針1和/或PNA種屬特異性探針2的序列：

7.根據權利要求6所述的方法或試劑盒，期特征在于另一個用于分型的序列選自以下三條探針之一：?

??探針名稱 ??序列 ??P3b ??5’-NH₂-(CH2)₆-TGTGTTTACTGAGTG-3’ ??P3c ??5’-NH₂-(CH2)₆-AACGCCCACATGATCT-3’ ??P3d ??5’-NH₂-(CH2)₆-CGGTACGAGATCTTCTA-3’