[發明專利]利用SSR引物鑒定大麥品種的方法及其應用

有效

• 申請號: 201210326416.3
• 申請日: 2012-09-06
• 公開（公告）號: CN102787172A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 王艷平;沈奇;張繼紅;李華勇;吳燕;王顯生
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 程化銘

1.??一種利用SSR引物鑒定大麥品種的方法，包括提取供試品種樣品的DNA、用SSR引物進行PCR擴增，對PCR擴增產物進行凝膠電泳，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染，SSR譜帶分析，其特征在于：所述的供試品種樣品至少為兩個大麥品種，所述的SSR引物包括14對基本核心SSR引物和14對擴展核心SSR引物，其中，14對基本核心SSR引物為Bmag0211?、Bmag0378、Bmag0711、Bmac0209、Bmag0877、EBmac0701、EBmac0635、Bmag0353、Scssr10148、Scssr03907、Bmag0009、Bmag0867、HVCMA和EBmac0603對應的引物，14對擴展核心SSR引物為Scssr02748、HVM54、Scssr07759、HvXan、HVM27、HVM60、HVM40、Bmac0181、Scssr07106、Bmag0387、Bmac0018、Scssr09398、Bmac0064和Scssr15864對應的引物；具體步驟如下：

提取供試品種樣品的DNA；

用14對基本核心SSR引物分別對供試品種模板DNA進行PCR擴增，其中的PCR擴增反應總體積為25?μL，擴增反應體系為：SuperTaq??5U/μL的DNA?Polymerase??0.2?μL，2.5mmol/L的dNTP?2?μL，含Mg²⁺的10×PCR?Buffer?2.5?μL，10?μmol/L的每對引物的上游和下游引物各1μL，供試大麥品種基因組20?ng/μL的DNA模板1?μL，雙蒸水補足25μL；PCR反應程序為94℃預變性5min，35個擴增循環，94℃?30?sec，47～62℃?30?sec，72℃?1min，72℃?延伸5min，4℃保存；

供試大麥品種PCR擴增產物進行凝膠電泳，變性聚丙烯酰胺凝膠濃度為6%，凝膠組分為：6%變性聚丙烯酰胺溶液60?mL，TEMED?50?μL,10%?過硫酸胺?500?μL；設定功率50?W，1×TBE緩沖液電泳?2?h，關閉電源，進行染色；染色過程是：10%冰醋酸溶液固定20?min，超純水迅速水洗，0.2%硝酸銀溶液銀染30?min，超純水再次迅速水洗，顯影液顯色數分鐘，直至條帶清晰，10%冰醋酸溶液終止5?min，超純水再次水洗；

通過分析基本核心SSR結果，大麥品種間多態性位點的差異，確定等位變異數及多態性信息含量，在相同遷移率位置上進行“1、0”標注，構建大麥品種的SSR分析譜帶數據，利用這些數據對來源不明的大麥品種進行比較,如果品種間差異位點數≥3，判定為不同品種，形成鑒定結果；如果品種間差異位點數小于2,則轉入e步驟；

再用14個擴展核心SSR引物對采用供試品種模板DNA進行PCR擴增，其中的PCR擴增反應總體積和擴增反應體系均與b步驟相同；并按照d步驟進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染；

綜合分析基本核心SSR和擴展核心SSR引物的結果，確定等位變異數及多態性信息含量，在相同遷移率位置上進行“1、0”標注，構建大麥品種的SSR分析譜帶數據，品種間差異位點數≥3，判定為不同品種；品種間差異位點數為1或2，判定為近似品種；品種間差異位點數為0，判定為疑同品種，形成鑒定結果；

????所述的6%變性聚丙烯酰胺溶液為420g尿素，10×TBE?50?mL，40%?PAG?150?mL，去離子水定容至1000?mL；所述的10%冰醋酸溶液是將100?mL冰醋酸，加入1000?mL去離子水；所述的0.2%硝酸銀溶液是將2.0?g硝酸銀，溶于1000?mL去離子水中；所述的顯影液是將15?g?氫氧化鈉溶于1000?mL去離子水中，再加入5?mL甲醛。

2.根據權利要求1所述的利用SSR引物鑒定大麥品種的方法，其特征在于：提取供試品種樣品的DNA是指：對來源不明的大麥品種進行隨機取樣，每份樣品取單株5株，取幼苗葉片0.5?g混合為一個樣本，剪碎，放入2?mL離心管中，往離心管中加入液氮冷凍，放入研磨儀，磨成粉狀后立即加入預熱的DNA提取液790～810μL，劇烈搖動混勻，并在65℃水浴中保溫30～50?min，搖動使其混勻。