[發(fā)明專利]一種檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法及試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210325456.6
• 申請日: 2012-09-05
• 公開（公告）號: CN102787171A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐華;葉世輝;吳大洲;王滿妮;左琴琴;段勇
• 申請（專利權(quán)）人: 陜西省血液中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種能夠檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法，以及應(yīng)用此方法制備的體外診斷試劑盒，可以檢測出人類RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。

技術(shù)背景

在本文中，術(shù)語“Rh”是恒河猴(Rhesus?Macacus)外文名稱的頭兩個字母。RhD抗原自1939年被發(fā)現(xiàn)以來，因?qū)е滦律鷥喝苎　l(fā)生血管外遲發(fā)性溶血性輸血反應(yīng)而成為紅細(xì)胞中僅次于ABO血型的重要抗原。Rh血型的抗原性很強(qiáng)，尤其以D抗原最強(qiáng)，僅次于ABO系統(tǒng)的A和B抗原。凡是人紅細(xì)胞上有RhD抗原者，為Rh陽性，反之為陰性。RhD陰性血型在中國人中所占比例約為3～5‰，屬于稀有血型。50％～75％的Rh陰性個體通過輸血和妊娠，可受D抗原紅細(xì)胞免疫而產(chǎn)生抗D；隨著對Rh血型的不斷研究，認(rèn)為Rh血型系統(tǒng)可能是紅細(xì)胞血型中最為復(fù)雜的一個血型系。世界各國的衛(wèi)生組織都嚴(yán)格規(guī)定，個體在輸血時，只能輸用Rh陰性血液。Rh血型的發(fā)現(xiàn)，對更加科學(xué)地指導(dǎo)輸血工作和進(jìn)一步提高新生兒溶血病的實驗診斷和維護(hù)母嬰健康，都有非常重要的意義。Rh抗原是由位于1號染色體短臂上的兩個同源及緊密連鎖的基因所編碼，即RhD和RhCE基因，每個基因都是由10個外顯子組成；RhD基因編碼D抗原，RhCE基因編碼Cc和Ee抗原。RhD和RhCE的外顯子與內(nèi)含子有93.8％的同源性，外顯子1～7編碼50～60個氨基酸，外顯子8～10編碼最后58個殘基。兩者最顯著的區(qū)別是內(nèi)含子4，RhD的內(nèi)含子4少了約600bp。RhD和RhCE基因分別長57295bp和57831bp，兩個基因相隔約30kb，尾對尾形成排列(5’RhD3’-3’RhCE5’)，中間隔差一個功能未知的小膜蛋白1基因(SMP1基因)，RhD基因的兩端存在有兩個具有98.6％同源性的區(qū)域被稱為Rh盒子(Rh?boxes)；RhD陰性的RhD基因缺失，兩端的Rh?boxes基因部分缺失后熔合形成單一雜合的Rh盒子(Rh?box-hybrid)，成為RhD陰性基因的特征。見附圖1。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)一些血清學(xué)初檢RhD陰性的個體經(jīng)過進(jìn)一步敏感的血清學(xué)檢驗，如吸收放散試驗，可以能檢出D抗原的存在，即部分RhD陰性個體擁有難以檢測出的D抗原。進(jìn)一步的研究顯示，此類D抗原又可以分為部分D(partrial-D)和弱表現(xiàn)型D(weak-D)兩種類型；部分D個體制表達(dá)部分而非完整的D抗原，在數(shù)量和本質(zhì)上都與RhD陽性的D抗原有區(qū)別，而弱D表達(dá)的D抗原是完整的與RhD陽性相比，只有在D抗原數(shù)量上有顯著區(qū)別。這兩類特殊血型中都可以檢出D基因，這就有兩個方面值得探討：一是這些個體的基因?qū)儆诔聊蚧驘o效基因；二是這些個體并非真實RhD陰性，而是D抗原較弱，一般檢測方法未檢測到RhD抗原。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)RhD陰性的個體中存在著一種重要的RhD的弱表現(xiàn)型：DEL(D-elution，elution中文意為洗脫)，DEL在所占比例在不同文獻(xiàn)報告中所占的比例也不同，國外報告在黑人和日本人中DEL比例較高，約30～50％，中國人初篩RhD陰性的人群中香港報告DEL占30％，內(nèi)地占20～30％。

目前已證實DEL基因外顯子均無缺失，RhD基因表達(dá)調(diào)控的差異可能是DEL的產(chǎn)生原因，已有的研究顯示在中國大陸、中國臺灣和日本等地的DEL血型，都是由于在RhD基因第9外顯子的1227位發(fā)生G＞A的突變引起的，導(dǎo)致mRNA產(chǎn)生變異，使蛋白質(zhì)的表達(dá)量減少，但抗原性質(zhì)未變；而1227位的G＞A突變也成為東亞人群的特異的很重要的基因標(biāo)記。

DEL血型引起了日益增加的關(guān)注主要源于兩個方面：一是目前國內(nèi)外對DEL血型作為RhD陰性血型對待，DEL血液仍用于供給RhD陰性患者使用，但國內(nèi)外都有越來越多的報道證實RhD陰性患者輸用DEL血液后，產(chǎn)生了抗-D抗體或體內(nèi)抗-D抗體效價升高，可能引起輸血反應(yīng)，成為臨床輸血中的不安全因素；二是DEL表達(dá)的D抗原是完整的D抗原，DEL血型的患者是否能夠輸用D陽性血液，從而節(jié)約寶貴的RhD陰性血液資源？以上的研究都必須對DEL血型進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，同時大規(guī)模的檢測也需要采用可靠、簡便和經(jīng)濟(jì)的方法才能夠進(jìn)行。

用免疫血清學(xué)的方法對DEL血型的檢出有賴于使用的抗-D試劑和操作方法，可靠性較低，而且由于步驟繁瑣而不適合臨床大規(guī)模應(yīng)用，可靠的方法是應(yīng)用基因檢測的方法來檢出DEL血型。目前，國外已有多種根據(jù)1227位發(fā)生G＞A的突變而設(shè)計的檢測試劑盒問世，可用于DEL血型的檢出，但存在以下缺點(diǎn)：