[發明專利]一種檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法及試劑盒

無效

• 申請號: 201210325456.6
• 申請日: 2012-09-05
• 公開（公告）號: CN102787171A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 徐華;葉世輝;吳大洲;王滿妮;左琴琴;段勇
• 申請（專利權）人: 陜西省血液中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測人類RhD血型基因型的試劑盒，該試劑盒包含：

(1)引物混合物1管；

所述引物混合物由下列序列組成：

SEQ?ID?NO1、SEQ?ID?NO2、SEQ?ID?NO3、SEQ?ID?NO4、SEQ?ID?NO5、SEQ?ID?NO6、SEQ?ID?NO7和SEQ?ID?NO8，其序列見說明書中表1。

(2)PCR引物緩沖液1管；

(3)Taq聚合酶1管；

(4)dNTP混合物1管；

(5)陽性對照2管，陰性對照1管；以及

(6)使用說明書。

2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于引物混合物的混合比例為SEQ?ID?NO1∶SEQ?ID?NO2∶SEQ?ID?NO3∶SEQIDNO4∶SEQIDNO5∶SEQIDNO6∶SEQIDNO7∶SEQIDNO8＝4∶4∶1∶1∶1.5∶1.5∶6.5∶6.5。

3.如權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于PCR引物緩沖液包含2.0μl?500mM?KCl、2.0μl?100mMTris-HCl(PH?9.0)、2.0μl?25mM?MgCl₂、0.2μl?1.0M(NH₄)₂SO₄、0～2.0μl?DMSO、0～1.0μl甘油和4.0～6.1μl?DDW。

4.如權利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特征在于，其中所述的所述PCR引物緩沖液包含2.0μl?500mMKCl、2.0μl?100mM?Tris-HCl(PH?9.0)、2.6μl?25mM?MgCl₂、0.2μl?1.0M(NH₄)₂SO₄、1.0μl?DMSO和5.0μl?DDW。

5.一種檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法，該方法包括步驟：

(1)在0.5mL的Ependoff管內加入12.8μl?PCR引物緩沖液、2.0μl引物混合物、2.0μldNTP混合物、0.2μl?TaqDNA聚合酶和3.0μl模板DNA，充分混合，所述引物混合物由下列序列組成：SEQ?ID?NO1、SEQ?ID?NO2、SEQ?ID?NO3、SEQ?ID?NO4、SEQ?ID?NO5、SEQ?ID?NO6、SEQ?ID?NO7和SEQ?ID?NO8，其序列見說明書中表1；

(2)將Ependoff管放入PCR擴增儀中，94℃變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應94℃、40秒，56℃、40秒和72℃、1分鐘，隨后72℃延伸5分鐘，然后將溫度降低到4℃；以及

(3)取出PCR產物，4％瓊脂糖凝膠電泳(200V，20分鐘)，紫外燈下觀察結果并拍照。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，其中所述PCR引物緩沖液包含2.0μl?500mM?KCl、2.0μl?100mMTris-HCl(PH?9.0)、2.0μl?25mM?MgCl₂、0.2μl?1.0M(NH₄)₂SO₄、0～2.0μl?DMSO、0～1.0μl甘油和4.0～6.1μlDDW。

7.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于，其中所述PCR引物緩沖液包含2.0μl?500mM?KCl、2.0μl?100mM?Tris-HCl(PH?9.0)、2.6μl?25mM?MgCl₂、0.2μl?1.0M(NH₄)₂SO₄、1.0μl?DMSO和5.0μl?DDW。

8.如權利要求5-7任一項所述的方法，其特征在于，其中所述引物混合物包含SEQ?ID?NO1、SEQ?ID?NO2、SEQ?ID?NO3、SEQ?ID?NO4、SEQ?ID?NO5、SEQ?ID?NO6、SEQ?ID?NO7和SEQ?ID?NO8，本發明提供的最佳混合比例為：SEQ?ID?NO1∶SEQ?ID?NO2∶SEQ?ID?NO3∶SEQ?ID?NO4∶SEQ?ID?NO5∶SEQ?ID?NO6∶SEQ?ID?NO7∶SEQ?ID?NO8＝4∶4∶1∶1∶1.5∶1.5∶6.5∶6.5。

9.如權利要求1-4中任一權利要求所述的試劑盒用于檢測人類RhD血型基因型，可以檢測出人類RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。