[發明專利]從骨髓中一次性同時培養獲得基質干細胞與內皮祖細胞的制備方法及其用途

在審

• 申請號: 201210324726.1
• 申請日: 2012-09-05
• 公開（公告）號: CN102796702A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 陳鎮洲;郭陽
• 申請（專利權）人: 陳鎮洲
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/071;A61K35/28;A61P9/10;A61P7/04
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技術領域

本發明涉及從骨髓中一次性同時培養獲得基質干細胞與內皮祖細胞的制備方法。本發明涉及的能快速增殖、操作簡便同時得到基質干細胞與內皮祖細胞兩種細胞，滿足臨床上高數量級的治療需要，用于心腦血管的缺血性和出血性疾病治療。

背景技術

骨髓基質干細胞是骨髓中非造血實質細胞的干細胞能分化為骨、軟骨、脂肪和神經等細胞，也參與機體免疫調節作用。內皮祖細胞是血管內皮細胞的前體細胞，參與損傷血管的修復。骨髓基質干細胞和內皮祖細胞都能用于心腦血管缺血性和出血性疾病治療，用于調節機體內環境，進行修復損傷血管。

目前基質干細胞主要來源是骨髓、臍血、臍帶和胎盤等，內皮祖細胞來源主要為骨髓、臍血和外周血。但是它們在其中含量都很低，細胞擴增較難，對它們在研究和應用中受到限制。通常基質干細胞和內皮祖細胞分別需要50ml或更多的骨髓或臍血進行密度梯度離心分離，然后在細胞因子作用下進行體外培養獲得。這樣一來，每次采集的骨髓或臍血只能用于一種細胞的擴增培養基質干細胞或者內皮祖細胞，獲得足夠使用的數量級的細胞數。由于基質干細胞和內皮祖細胞都對心腦血管疾病治療有很大的療效作用，基質干細胞可以改善機體內環境，包括分泌營養因子和調節機體免疫炎癥反應，有助于其或者內皮祖細胞更多地在體內分化為內皮細胞，更好地修復損傷血管。因而從自體骨髓中一次性同時培養獲得基質干細胞和內皮祖細胞是很必要的，可聯合兩者進行應用，發揮最佳的功能。

目前純化和擴增培養方法只能獲得基質干細胞或內皮祖細胞其中一種，并且方法較復雜，成本高、耗時較長，很大程度上制約了兩者在臨床治療中的使用。

發明內容

本發明的目的就在于為了能一次性同時培養獲得基質干細胞和內皮祖細胞，克服上述現有技術的缺陷，提供一種從骨髓中一次性同時培養獲得基質干細胞與內皮祖細胞的制備方法，所述制備方法包括：5-20ml骨髓直接經葡蔗糖-泛影酸納溶液密度梯度離心分離，并通過1×PBS(pH值7.4)洗滌三次獲得單個核細胞；一半單個核細胞在α-MEM完全培養基培養獲得基質干細胞；另一半單個核細胞在EGM-2完全培養基中培養獲得基質干細胞。

所述的基質干細胞與內皮祖細胞制備方法，其特征在于，基質干細胞在α-MEM完全培養基(10％(v/v)胎牛血清、20ng/mL堿性成纖維生長因子)中原代培養，當培養瓶中生長到80％以上，用0.025％(m/v)胰酶消化后進行擴增，每次1瓶培養瓶擴增到2瓶，連續擴增5代，可達到2×10⁸以上細胞數量級。

內皮祖細胞在EGM-2完全培養基(5％(v/v)胎牛血清、50ng/mL表皮生長因子、50ng/mL血管內皮生長因子、50ng/mL人胰島素樣生長細胞因子、1ug/mL氫化可的松)中原代培養，當用3μg/cm2纖維連接蛋白包被的培養瓶中生長到80％以上，用0.025％(m/v)胰酶消化后進行擴增，每次1瓶培養瓶擴增到2瓶，連續擴增5代，可達到2×10⁸以上細胞數量級。

其中體外增殖培養獲得基質干細胞的表型中CD90、CD44、CD105和CD73陽性率達到90％以上，CD14、CD34、CD45和HLA-DR陽性率低于5％以下；符合基質干細胞表達的標志物要求。

擴增得到的內皮祖細胞表型中CD31陽性率達到90％以上，血管內皮生長因子受體2(KDR)、CD34陽性率為15～20％，CD133陽性率低于5％以下，符合內皮祖細胞表達的標志物要求。

所述獲得的基質干細胞與內皮祖細胞可同時或單獨用于臨床應用，進行治療心血管和腦血管疾病，最佳地發揮兩者在臨床治療中的功能，基質干細胞可以改善機體內環境，包括分泌營養因子和調節機體免疫炎癥反應，有助于其或者內皮祖細胞更多地在體內分化為內皮細胞，更好地修復損傷血管。

附圖說明

圖1表示本發明中一次性同時獲得的基質干細胞和內皮祖細胞形態圖；

圖2表示本發明中獲得基質干細胞流式細胞檢測結果圖；

圖3表示本發明中獲得基質干細胞聯合內皮祖細胞體內移植mNSS評分曲線圖；

圖4表示本發明中獲得基質干細胞聯合內皮祖細胞體內移植后隨著時間變化進行腦損傷面積改善曲線圖；

圖5表示本發明中獲得基質干細胞聯合內皮祖細胞體內移植后對缺血性腦卒中大鼠新生毛細血管分支點數圖。

具體實施方式