[發明專利]從骨髓中一次性同時培養獲得基質干細胞與內皮祖細胞的制備方法及其用途

在審

• 申請號: 201210324726.1
• 申請日: 2012-09-05
• 公開（公告）號: CN102796702A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 陳鎮洲;郭陽
• 申請（專利權）人: 陳鎮洲
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/071;A61K35/28;A61P9/10;A61P7/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種從骨髓中一次性同時培養獲得基質干細胞與內皮祖細胞的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括：5-20ml骨髓直接經葡蔗糖-泛影酸納溶液密度梯度離心分離，并通過1×PBS洗滌三次獲得單個核細胞；然后將一半所述單個核細胞在α-MEM完全培養基培養獲得基質干細胞，另一半所述單個核細胞在EGM-2完全培養基中培養獲得內皮祖干細胞；

其中，基質干細胞的制備過程為，將一半所述單個核細胞在α-MEM完全培養基中原代培養，當培養瓶中基質干細胞生長到80％以上，用0.025％胰酶消化后進行擴增，每次1瓶培養瓶擴增到2瓶，連續擴增5代，其細胞數量級達到2×10⁸以上；其中，所述的α-MEM完全培養基包括10％胎牛血清、20ng/mL堿性成纖維生長因子；

內皮祖細胞的制備過程為，另一半所述單個核細胞在EGM-2完全培養基中原代培養，當內皮祖細胞在用3μg/cm²纖維連接蛋白包被的培養瓶中生長到80％以上，用0.025％胰酶消化后進行擴增，每次1瓶培養瓶擴增到2瓶，連續擴增5代，其細胞數量級達到2×10⁸以上；其中，所述的EGM-2完全培養基包括5％胎牛血清、50ng/mL表皮生長因子、50ng/mL血管內皮生長因子、50ng/mL人胰島素樣生長細胞因子、1ug/mL氫化可的松。

所述胎牛血清的濃度為v/v，所述胰酶的濃度m/v，所述PBS的pH值為7.4。

2.根據權利要求1所述的基質干細胞與內皮祖細胞，其特征在于，所述擴增得到的基質干細胞的表型中CD90、CD44、CD105和CD73陽性率達到90％以上，CD14、CD34、CD45和HLA-DR陽性率低于5％以下；

所述擴增得到的內皮祖細胞的表型中CD31陽性率達到90％以上，血管內皮生長因子受體2(KDR)、CD34陽性率為15～20％，CD133陽性率低于5％以下。

3.一種從骨髓中一次性同時培養獲得基質干細胞與內皮祖細胞的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括：

采集20mL骨髓，采用Ficoll密度梯度離心分離，經1×PBS洗滌三次，得到的單個核細胞，計數；20mL骨髓獲得約40×10⁶cells單個核細胞；其中，所述PBS的pH值為7.4；

將一半單個核細胞重懸在α-MEM完全培養基中，添加到25cm²培養瓶中，每瓶5mL，細胞濃度為2×10⁶cells/mL，在5％CO₂中在37℃下開始培養；其中，所述的α-MEM完全培養基包括10％胎牛血清、20ng/mL堿性成纖維生長因子；

將另一半單個核細胞重懸在EGM-2完全培養基中原代培養，添加到3μg/cm²纖維連接蛋白包被的25cm²培養瓶中，每瓶5mL，細胞濃度為2×10⁶cells/mL，在5％CO₂中在37℃下開始培養；其中，所述的EGM-2完全培養基包括5％胎牛血清、50ng/mL表皮生長因子、50ng/mL血管內皮生長因子、50ng/mL人胰島素樣生長細胞因子、1ug/mL氫化可的松；

當所述基質干細胞和內皮祖細胞在培養瓶中生長到80％以上，用0.025％胰酶消化后進行擴增，第一次擴瓶中為每2瓶25cm²培養瓶擴增到1瓶75cm²培養瓶，分別使用各自新鮮的完全培養基遷行傳代培養，其中內皮祖細胞需使用3μg/cm²纖維連接蛋白包被的培養瓶；以后每1瓶75cm²培養瓶擴增到2瓶，連續擴增5代，其中培養內皮祖細胞時不再使用3μg/cm²纖維連接蛋白包被的培養瓶；基質干細胞和內皮祖細胞增殖培養后均可達到2×10⁸以上細胞數量級。

所述胎牛血清的濃度為v/v，所述胰酶的濃度m/v。