[發明專利]一種動物源性食品中殘留慶大霉素的可視化蛋白芯片檢測方法

有效

• 申請號: 201210324706.4
• 申請日: 2012-09-04
• 公開（公告）號: CN102788877A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 李周敏;孫思云
• 申請（專利權）人: 南京祥中生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/552
• 分類號: G01N33/552;G01N33/531
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術領域

本發明涉及一種動物源性食品中殘留慶大霉素的可視化蛋白芯片檢測方法，屬于食品安全監督或食品分析的免疫分析技術領域。

背景技術

慶大霉素屬氨基糖苷類抗生素，抗生素作為獸藥和飼料添加劑被廣泛應用，可能會造成抗生素在動物源性食品中的殘留。對于牛奶等乳制品，抗生素殘留不僅會影響乳制品的品質，如嚴重影響發酵乳制品的生產，降低產量及破壞后期產品風味，給生產者造成經濟損失，而且會對人體造成極大的危害，如引起人體的過敏反應（如：皮疹、過敏性休克等），抑制腸道中正常的敏感菌群的生長，使致病菌、念珠菌大量增殖而導致全身或局部感染，并且會導致人體對抗生素產生抗藥性，給臨床治療帶來不可估量的危害。目前，牛奶、蜂蜜、家禽、水產中的抗生素殘留已引起消費者的高度重視，因此，加強抗生素的殘留檢測尤為重要。

慶大霉素常用的檢測方法有：理化檢測法和免疫法。理化檢測法以HPLC和HPLC-MS為主，但是該法對設備要求高，技術難度大，對技術人員要求高，操作繁瑣，不適合現場監控和大量樣本的篩查。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種可半定量或定量檢測動物源性食品中慶大霉素含量的可視化蛋白芯片方法，在于彌補現有抗生素同時半定量、定量檢測技術的空白。滿足對該種抗生素進行快速篩選的要求，提供一種快速，高靈敏度，低成本的檢測動物源性食品中慶大霉素的可視化蛋白芯片檢測方法。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

方法一：定量檢測方法。

一種動物源性食品中殘留慶大霉素的可視化蛋白芯片檢測方法，該方法依次順序包括如下步驟：

(1)以牛血清白蛋白（BSA）為空白對照，將牛血清白蛋白和慶大霉素-載體蛋白偶聯物通過生物芯片點樣儀進行點樣操作，點樣板孔內分別加入10~50μL的牛血清白蛋白和10~50μL的慶大霉素-載體蛋白偶聯物，將點好的玻片放在4℃冰箱中固定過夜；

(2)固定后每個反應孔內加入10~100μL?1~50mg/mL的牛血清白蛋白緩沖溶液對芯片進行封閉1~3h，然后PBST洗滌3-4次，每次3-15min；封閉的目的是防止待測樣品中的蛋白質與其他活性基團非特異性結合，形成高背景或假陽性；

(3)在部分反應孔內加入10~100μL慶大霉素抗體和不同濃度的游離慶大霉素的標準溶液，在剩余反應孔內加入10~100μL慶大霉素抗體和樣品溶液，所有反應孔20~37℃水浴反應1~3h，然后PBST洗滌3~4次，每次3~15min；

(4)在每個反應孔內加入10~100μL膠體金標記羊抗鼠IgG，20~37℃水浴反應1~3h，然后PBST洗滌3~4次，每次3~15min；

(5)在每個反應孔內加入10~100μL銀增強顯色劑，避光顯色反應5~30min后，終止反應；

(6)用CCD平板掃描儀進行圖像掃描，根據不同濃度的慶大霉素包被抗原的灰度值信號，利用外標曲線法定量檢測樣品中慶大霉素的含量。

方法二：半定量和定量檢測方法。

一種動物源性食品中殘留慶大霉素的可視化蛋白芯片檢測方法，該方法依次順序包括如下步驟：

(1)以牛血清白蛋白（BSA）為空白對照，將牛血清白蛋白、慶大霉素-載體蛋白偶聯物和不同濃度鼠IgG內標物通過生物芯片點樣儀進行點樣操作，點樣板孔內分別加入10~50μL的牛血清白蛋白和10~50μL的慶大霉素-載體蛋白偶聯物，以及10-50μL4個不同濃度的鼠IgG內標物，將點好的玻片放在4℃冰箱中固定過夜；

(2)固定后每個反應孔內加入10~100μL?1~50mg/mL的牛血清白蛋白緩沖溶液對芯片進行封閉1~3h，然后PBST洗滌3-4次，每次3-15min；封閉的目的是防止待測樣品中的蛋白質與其他活性基團非特異性結合，形成高背景或假陽性；

(3)在部分反應孔內加入10~100μL慶大霉素抗體和不同濃度的游離慶大霉素的標準溶液，在剩余反應孔內加入10~100μL慶大霉素抗體和樣品溶液，所有反應孔20~37℃水浴反應1~3h，然后PBST洗滌3~4次，每次3~15min；

(4)在每個反應孔內加入10~100μL膠體金標記羊抗鼠IgG，20~37℃水浴反應1~3h，然后PBST洗滌3~4次，每次3~15min；

(5)在每個反應孔內加入10~100μL銀增強顯色劑，避光顯色反應5~30min后，終止反應；