[發(fā)明專利]一種動物源性食品中殘留慶大霉素的可視化蛋白芯片檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210324706.4
• 申請日: 2012-09-04
• 公開（公告）號: CN102788877A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發(fā)明（設計）人: 李周敏;孫思云
• 申請（專利權(quán)）人: 南京祥中生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/552
• 分類號: G01N33/552;G01N33/531
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

1.一種動物源性食品中殘留慶大霉素的可視化蛋白芯片檢測方法，其特征在于，該方法依次順序包括如下步驟：

(1)以牛血清白蛋白為空白對照，將牛血清白蛋白和慶大霉素-載體蛋白偶聯(lián)物通過生物芯片點樣儀進行點樣操作，點樣板孔內(nèi)分別加入10~50μL的牛血清白蛋白和10~50μL的慶大霉素-載體蛋白偶聯(lián)物，將點好的玻片放在4℃冰箱中固定過夜；

(2)固定后每個反應孔內(nèi)加入10~100μL?1~50mg/mL的牛血清白蛋白緩沖溶液對芯片進行封閉1~3h，然后PBST洗滌3-4次，每次3-15min；

(3)在部分反應孔內(nèi)加入10~100μL慶大霉素抗體和不同濃度的游離慶大霉素的標準溶液，在剩余反應孔內(nèi)加入10~100μL慶大霉素抗體和樣品溶液，所有反應孔20~37℃水浴反應1~3h，然后PBST洗滌3~4次，每次3~15min；

(4)在每個反應孔內(nèi)加入10~100μL膠體金標記羊抗鼠IgG，20~37℃水浴反應1~3h，然后PBST洗滌3~4次，每次3~15min；

(5)在每個反應孔內(nèi)加入10~100μL銀增強顯色劑，避光顯色反應5~30min后，終止反應；

(6)用CCD平板掃描儀進行圖像掃描，根據(jù)不同濃度的慶大霉素包被抗原的灰度值信號，利用外標曲線法定量檢測樣品中慶大霉素的含量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物源性食品中殘留慶大霉素的可視化蛋白芯片檢測方法，其特征在于，慶大霉素-載體蛋白偶聯(lián)物按如下步驟制備得到：

(1)將1~500mg慶大霉素溶于1~100mL?PBS緩沖液中，得到溶液I，在冰水浴中攪拌10~60min；

(2)將1~500mg碳二亞胺溶于1~100mLPBS緩沖液中，得到溶液II，在冰水浴中攪拌10~60min；

(3)稱1~200mg載體蛋白溶于1~100mLPBS緩沖液中，得到溶液III，在冰水浴中攪拌10~60min；

(4)攪拌條件下將溶液I加入溶液III中，再在冰水浴下，將溶液II液逐滴加入上述混合液中，攪拌避光反應1h，4℃反應2~24h，得到慶大霉素-載體蛋白偶聯(lián)物；

(5)將慶大霉素-載體蛋白偶聯(lián)物放入透析袋中，用PBS緩沖液，4℃，透析1~3天，每8h換一次透析液。

(6)透析后的慶大霉素-載體蛋白偶聯(lián)物進行紫外掃描，分析鑒定慶大霉素-載體蛋白偶聯(lián)物及濃度測定，分裝后于-20℃冰箱保存?zhèn)溆眉吹茫?/p>

其中，所述的載體蛋白為匙孔血藍蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙種球蛋白、酶或卵清蛋白。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物源性食品中殘留慶大霉素的可視化蛋白芯片檢測方法，其特征在于，牛血清白蛋白緩沖溶液，溶劑為PBS緩沖液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物源性食品中殘留慶大霉素的可視化蛋白芯片檢測方法，其特征在于，所述的銀增強顯色劑為Sigma-Aldrich公司的銀增強試劑A和銀增強試劑B按體積比1：1的混合液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物源性食品中殘留慶大霉素的可視化蛋白芯片檢測方法，其特征在于，樣品溶液處理方法如下：對于液體樣品，取50μL~1mL于10mL?EP管中，用PBS緩沖液稀釋10~100倍，用于分析；對于固體樣品，取粉碎樣品5g，加入8mL?PBS緩沖液，混合5min，置50℃水浴下放置30min，室溫3000r/min離心10min，取50μL上清液，加入450μLPBS緩沖液混勻，取50μL用于分析。