[發(fā)明專利]高增殖能力、高細(xì)胞毒活性、高存活率的CIK細(xì)胞制備方法、相關(guān)CIK細(xì)胞及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210324368.4
• 申請(qǐng)日: 2012-09-04
• 公開（公告）號(hào): CN102827809A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 凌丹彥;戴書縉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海易美生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0783
• 分類號(hào): C12N5/0783;C12N5/0786;A61K35/14;A61P35/00;A61P31/00;A61P37/02
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 王潔;鄭暄

1.一種高增殖能力、高細(xì)胞毒活性、高存活率的CIK細(xì)胞制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）將外周血單個(gè)核細(xì)胞分選去除CD4⁺CD25⁺Treg細(xì)胞，得到CIK前期細(xì)胞；

（2）將CIK前期細(xì)胞置于含有100ng/ml?PHA、100ng/ml?IL-6、10ng/ml?PGE2的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)；

（3）轉(zhuǎn)移至經(jīng)1ug/ml?CD3單抗包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入1000U/ml?IFN-γ培養(yǎng)48小時(shí)；

（4）加入1000U/ml?IL-2以及100ng/ml?IL-1α培養(yǎng)4天；

（5）加入1ug/ml胰島素繼續(xù)培養(yǎng)7-14天。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高增殖能力、高細(xì)胞毒活性、高存活率的CIK細(xì)胞制備方法，其特征在于，步驟（2）-（4）中涉及的培養(yǎng)的條件均為37℃、5%CO₂的條件。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高增殖能力、高細(xì)胞毒活性、高存活率的CIK細(xì)胞制備方法，其特征在于，步驟（1）中的外周血單個(gè)核細(xì)胞通過采集患者抗凝血并分離得到。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高增殖能力、高細(xì)胞毒活性、高存活率的CIK細(xì)胞制備方法，其特征在于，所述分離采用的方法為Ficoll密度梯度法。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高增殖能力、高細(xì)胞毒活性、高存活率的CIK細(xì)胞制備方法，其特征在于，步驟（1）中分選采用的方法是磁珠分選法。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高增殖能力、高細(xì)胞毒活性、高存活率的CIK細(xì)胞制備方法，其特征在于，步驟（2）中的細(xì)胞培養(yǎng)液是AIM-V無血清細(xì)胞培養(yǎng)液或X-VIVO無血清細(xì)胞培養(yǎng)液。

7.一種CIK細(xì)胞，其特征在于，由根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的高增殖能力、高細(xì)胞毒活性、高存活率的CIK細(xì)胞制備方法制備而成。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的CIK細(xì)胞在制備治療腫瘤、感染或其它免疫相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。

9.一種抑制外周血單個(gè)核細(xì)胞向CD4⁺CD25⁺Treg細(xì)胞分化的方法，其特征在于，在細(xì)胞培養(yǎng)液加入100ng/ml?IL-6和10ng/ml?PGE2培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞。

10.一種促進(jìn)CIK細(xì)胞增殖的方法，其特征在于，在CIK細(xì)胞培養(yǎng)4天后加入含胰島素至終濃度1ug/ml的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。