[發明專利]一種檢測西尼羅病毒抗體的重組抗原蛋白、試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201210322561.4
• 申請日: 2012-08-31
• 公開（公告）號: CN102827261A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 任瑞文;唐博恒;駱康杰;胡文龍;梁克峰
• 申請（專利權）人: 任瑞文
• 主分類號: C07K14/18
• 分類號: C07K14/18;C12N15/40;C12N15/70;G01N33/68;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 王會龍

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種診斷西尼羅病毒抗體的重組抗原蛋白及其制備方法，以及以該抗原蛋白作為包被抗原的西尼羅病毒檢測試劑盒。?

背景技術

西尼羅病毒(West?Nile?virus，WNV)屬黃病毒科黃病毒屬，為單股正鏈RNA病毒，與圣路易斯腦炎病毒(Saint-Louis?encephalitis?virus)和墨累河谷熱病毒(Murray?Valley?fever?virus)同屬日本腦炎病毒(Japanese?encephalitis?virus，JEV)血清群，可引起人和動物發生西尼羅河熱和西尼羅病毒腦膜腦炎，庫蚊屬的蚊子是其主要的傳播媒介，鳥類是該病毒的中間宿主，而人和馬則是終端宿主。WNV病廣泛分布于非洲、中東、歐洲的部分地區，以及前蘇聯、印度、印度尼西亞和亞洲的熱帶地區等。1999年夏季，WNV首次登陸美國，隨后幾年內在北美和中美洲迅速傳播，導致美國和加拿大等國家歷史上蟲媒病毒感染的最大流行。雖然我國至今沒有WNV疫情發生，但周邊國家和地區己經爆發該疫病，隨時有輸入性傳播的可能，而且作為一種潛在的生物戰劑，存在被用于生物恐怖襲擊的可能，加強相關領域的技術儲備，對于我國的公共衛生及生物安全保障具有重要意義。?

目前用于病毒免疫學檢測方法中，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法速度快，對實驗要求不高，并能自動化、高通量的檢測大量樣品，同時也具有靈敏度高、可靠性強的優勢，并且已經在不同的病原體檢測中得到廣泛應用，其操作已被廣大基層衛生防疫人員熟練掌握，具有較高的應用價值。免疫膠體金快速診斷技術則是基于酶聯免疫吸附試驗、乳膠凝集試驗、免疫膠體金技術的新型技術，于1989年首次用于檢測抗人類免疫缺陷病毒的抗體，其操作更為簡便快速，只?需幾分鐘，陽性反應肉眼可見，不需特殊儀器，不受環境溫度影響，試劑穩定易長期保存、特異性和敏感性均較高等優點，特別適用于野外以及實驗條件不具備的場所使用，并已在多種病毒的檢測中得到應用。在基層單位，以上兩種方法有其他方法無法代替的優勢，而其關鍵均在于特異性強、親和力高抗原的制備，以提高特異性及檢出率。?

現有技術中，關于西尼羅病毒免疫學診斷方法的研究方面，國內也已經見過多篇報道，但由于不同蟲媒病毒之間存在嚴重的血清學交叉反應，在那些存在多種蟲媒病毒流行的區域，由于混合感染，患者體內存在交叉抗體，使得免疫學診斷及鑒別診斷十分困難。同時，由于IgG抗體可以在宿主體內存在很長時間，有的超過10個月，甚至終生攜帶，使得鑒別過去、最近還是現在感染也十分困難，對抗原的質量也提出了更高的要求。?

發明內容

有鑒于此，本發明的所解決的技術問題在于提供一種檢測西尼羅病毒抗體的重組抗原蛋白及其制備方法，該重組抗原蛋白具有特異性強、親和力高的優點，與其它相近的蟲媒傳播病毒無血清學交叉反應，而與西尼羅病毒抗體具有極高親和力。?

本發明的所解決的技術問題在于提供一種西尼羅病毒的檢測試劑盒，利用所制備的重組抗原蛋白，建立西尼羅病毒抗體的ELISA快速檢測技術。?

為了解決上述技術問題，一方面，本發明提供一種檢測西尼羅病毒的重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白具有如SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列。?

優選地，所述重組抗原蛋白的編碼基因序列具有如SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。該重組抗原蛋白是通過選擇西尼羅病毒蛋白中呈現病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段，并將該目的基因片段通過原核表達載體導入宿主細胞中進行表答而制備得到，該目的基因片段具有如SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列，該目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區段，所述柔性臂能夠消除表達載體的融合蛋白對多肽表位的掩蓋，使表達的重組抗原蛋白正確折疊。?

另一方面，本發明具體實施方式中還提供了一種檢測西尼羅病毒抗體的重組抗原蛋白的制備方法，包括如下步驟：?

一、選擇西尼羅病毒蛋白中呈現病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段，該目的基因片段具有如SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列，該目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區段，所述柔性臂能夠消除表達載體的融合蛋白對多肽表位的掩蓋，使表達的重組抗原蛋白正確折疊；?

二、設計PCR擴增引物，并通過PCR擴增所述目的基因片段；?

三、通過限制性酶切和連接，將目的基因片段體連接到原核表達載體中，構建含有所述目的基因片段的重組表達質粒；?