[發明專利]一種檢測西尼羅病毒抗體的重組抗原蛋白、試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201210322561.4
• 申請日: 2012-08-31
• 公開（公告）號: CN102827261A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 任瑞文;唐博恒;駱康杰;胡文龍;梁克峰
• 申請（專利權）人: 任瑞文
• 主分類號: C07K14/18
• 分類號: C07K14/18;C12N15/40;C12N15/70;G01N33/68;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 王會龍

1.一種檢測西尼羅病毒抗體的重組抗原蛋白，其特征在于：所述重組抗原蛋白具有如SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列。

2.根據權利要求1所述的檢測西尼羅病毒抗體的重組抗原蛋白，其特征在于：所述重組抗原蛋白的編碼基因序列具有如SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。

3.一種檢測西尼羅病毒抗體的重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

一、選擇西尼羅病毒蛋白中呈現病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段，該目的基因片段具有如SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列，該目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區段，所述柔性臂能夠消除表達載體的融合蛋白對多肽表位的掩蓋，使表達的重組抗原蛋白正確折疊；

二、設計PCR擴增引物，并通過PCR擴增所述目的基因片段；

三、通過限制性酶切和連接，將目的基因片段體連接到原核表達載體中，構建含有所述目的基因片段的重組表達質粒；

四、將所述重組表達質粒轉化至感受態的表達宿主細胞中，培養所述表達宿主細胞使其產生重組抗原蛋白，并通過純化獲取重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白具有如SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列。

4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟二中采用的PCR擴增引物序列如下：

正向引物：CGGGATCCCCACCAGGCACTTCAGATCCA<SEQ?ID?NO.3>

反向引物：ACGCAAGCTTTTAGGCAATCTCATTCCCCATCTT<SEQ?ID?NO.4>。

5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于：所述原核表達載體為pMAL?c2x原核表達載體，所述表達宿主細胞為大腸桿菌。

6.一種西尼羅病毒的檢測試劑盒，包括抗體檢測板和ELISA反應液，其特征在于：所述抗體檢測板上包被有檢測西尼羅病毒抗體的重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白具有如SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列。

7.根據權利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒中ELISA反應液包括：酶結合物工作液，陽性對照，陰性對照，濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液，酶結合物工作液，陽性對照為西尼羅病毒抗體標準品，陰性對照為西尼羅病毒抗體陰性血清。

8.根據權利要求7所述的檢測試劑盒，其特征在于:所述酶結合物工作液為辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG。

9.根據權利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述抗體檢測板的制備過程包括如下步驟：

一、重組抗原蛋白的制備，包括如下步驟：

(1)、選擇西尼羅病毒蛋白中呈現病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段，該目的基因片段具有如SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列，該目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區段，所述柔性臂能夠消除表達載體的融合蛋白對多肽表位的掩蓋，使表達的重組抗原蛋白正確折疊；

(2)、設計PCR擴增引物，并通過PCR擴增所述目的基因片段；

(3)、通過限制性酶切和連接，將目的基因片段體連接到原核表達載體中，構建含有所述目的基因片段的重組表達質粒；

(4)、將所述重組表達質粒轉化至感受態的表達宿主細胞中，培養所述表達宿主細胞使其產生重組抗原蛋白，并通過純化獲取重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白具有如SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列；

二、將純化后的重組抗原蛋白固定于酶聯板，該過程包括將步驟一中純化得到的重組抗原蛋白分別以梯級濃度包被酶聯板，每孔50-200ul，4℃包被過夜，而后用磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌1-2分鐘；將其拍干后，用5%牛血清白蛋白溶液于37℃封閉1-3小時，晾干后即得到所述抗體檢測板。

10.如權利要求1或2所述的重組抗原蛋白在制備診斷西尼羅病毒試劑盒中的運用。