[發明專利]一種溫度控制細胞培養方法

有效

• 申請號: 201210320799.3
• 申請日: 2012-08-31
• 公開（公告）號: CN102796704A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 黨磊;張美姿;趙仁濱
• 申請（專利權）人: 北京天辰空間生物醫藥研發有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12N5/071;C12N5/02
• 代理公司: 北京華誼知識產權代理有限公司 11207
• 代理人: 劉月娥

技術領域

本發明屬于細胞生物學技術領域，特別是提供了一種溫度控制細胞培養方法，適用于空間搭載細胞培養。

技術背景

隨著中國航天事業的發展，?空間生物學效益的研究越來越深入，目前利用返回式衛星和神舟飛船搭載植物種子和微生物已進行了大量研究，但對于人和動物細胞，由于培養條件所限，研究的較少，特別是經過衛星和飛船搭載得到活細胞的研究更是鮮有報道。

由于飛行器在發射和入軌前條件較為復雜，會使細胞受到影響，研究人員往往希望在此階段細胞處于休眠狀態，在飛行器入軌后再對細胞進行激活。目前國內也有一些細胞搭載培養裝置，但都需要航天員人工操作，需要航天員定時加入激活劑以保證在軌階段細胞的生長。

發明內容

本發明的的目的在于提供一種溫度控制細胞培養方法，通過溫度控制進行細胞培養，工藝步驟如下：

1.?微載體準備

稱取100-500毫克微載體（由纖維素、粘多糖、膠原、聚苯乙烯、硅、丙烯酰胺中的一種或幾種制成）于離心管中，加入10-40毫升磷酸鹽緩沖液（DPBS，由1-8克/升的氯化鈉、0.1-0.2克/升的氯化鉀、1-2克/升的磷酸氫二鈉、0.1-0.2克/升的磷酸二氫鉀制成），室溫浸泡1-4小時后，更換新的磷酸鹽緩沖液進行清洗2次后，去除磷酸鹽緩沖液，放入高壓滅菌鍋115-121℃滅菌15-30分鐘。取出后去除多余水分，加入含體積百分數5-10％胎牛血清的完全培養基平衡10-24h，得到可以用于細胞生長的微載體；

2.?細胞接種

取處于對數生長期的腫瘤細胞如小鼠黑色素瘤細胞（B16細胞）、腎上皮細胞（293細胞）、人肺癌細胞（H1299）等，或原代培養細胞如人皮膚成纖維細胞（ESF細胞）、小鼠胚胎成纖維細胞（3T3-L1細胞），細胞數量為1-10×10⁶個，用0.05-0.25％（體積百分數）的胰蛋白酶消化后，用細胞計數板計數細胞數量，使用含1-15％（體積百分數）胎牛血清的完全培養基調整細胞數量為0.5-2×10⁵個細胞?/毫升，加入步驟1得到的可用于細胞生長的微載體，使其濃度為1-10毫克/毫升，得到細胞與微載體的混合物。將該混合物置于培養皿內，放入37℃、5％CO₂的培養箱中，1-5小時內每15-30分鐘搖晃一次培養皿，使細胞與微載體完全接觸。培養4-16小時后，細胞已全部貼附于微載體上生長；

3.?細胞培養的溫度控制

將步驟2得到的已生長于微載體上的細胞，轉入新的培養皿中，加入含1％或10％（體積百分數）胎牛血清的完全培養基，蓋上蓋子，封口膜封口，分別放置于20-25℃及37℃溫度控制器內。

4.?細胞增殖情況檢測

生長于微載體上的細胞，在20-25℃及37℃溫度控制器內放置24-240小時后，取出搖勻，取100-1000微升細胞懸液，加入1-15％（體積百分數）的CCK-8，25-37℃孵育1-4小時，取上清液于酶標板中，使用酶標儀在450-550納米波長下檢測上清液的OD值，OD值反應細胞的増殖。此時細胞不増殖，細胞處于休眠狀態，但仍有活性。

將含1％胎牛血清的培養基換成含10％胎牛血清的完全培養基，將溫度控制器升溫至37℃繼續培養24-240小時，取100-1000微升細胞懸液用上述CCK-8方法檢測細胞增殖情況，此時細胞已開始増殖，且與一直放置于37℃培養的對照組細胞沒有顯著差異。

本發明所述的微載體為球形，直徑在60-87微米。

本發明所述的所述的CCK-8是一種用于測定細胞増殖或毒性實驗中活細胞數目的高靈敏度的比色檢測法，其顏色變化與細胞數量成正比。

本發明的優點在于，在一些特殊條件下，如空間細胞搭載時，在飛行器入軌前，通過溫度控制，使細胞處于休眠狀態，細胞不受外界環境影響，飛行器入軌后再通過溫度控制激活細胞，這樣不僅能獲得較多的活細胞，保證了有足夠的實驗材料進行后續實驗，同時細胞只受空間環境的影響，減少了在飛船入軌前細胞受到的影響，更能準確反應空間環境對細胞的影響，同時不需要航天員額外的操作，較少了航天員的工作量及工作難度。

附圖說明

圖1為B16細胞使用溫度控制方法培養細胞的増殖。

圖2為ESF細胞使用溫度控制方法培養細胞的増殖。