[發明專利]一種溫度控制細胞培養方法

有效

• 申請號: 201210320799.3
• 申請日: 2012-08-31
• 公開（公告）號: CN102796704A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 黨磊;張美姿;趙仁濱
• 申請（專利權）人: 北京天辰空間生物醫藥研發有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12N5/071;C12N5/02
• 代理公司: 北京華誼知識產權代理有限公司 11207
• 代理人: 劉月娥

1.一種溫度控制細胞培養方法，其特征在于，工藝步驟如下：

（1）微載體準備

稱取100-500毫克微載體于離心管中，加入10-40毫升磷酸鹽緩沖液DPBS，室溫浸泡1-4小時后，更換新的磷酸鹽緩沖液進行清洗2次后，去除磷酸鹽緩沖液，放入高壓滅菌鍋115-121℃滅菌15-30分鐘；取出后去除多余水分，加入含體積百分數5-10％胎牛血清的完全培養基平衡10-24h，得到用于細胞生長的微載體；

（2）細胞接種

取處于對數生長期的腫瘤細胞或原代培養細胞，細胞數量為1-10×10⁶個，用0.05-0.25體積％的胰蛋白酶消化后，用細胞計數板計數細胞數量，使用含1-15體積％胎牛血清的完全培養基調整細胞數量為0.5-2×10⁵個細胞?/毫升，加入步驟（1）得到的用于細胞生長的微載體，使其濃度為1-10毫克/毫升，得到細胞與微載體的混合物；將該混合物置于培養皿內，放入37℃、5％CO₂的培養箱中，1-5小時內每15-30分鐘搖晃一次培養皿，使細胞與微載體完全接觸；培養4-16小時后，細胞已全部貼附于微載體上生長；

（3）細胞培養的溫度控制

將步驟(2)得到的已生長于微載體上的細胞，轉入新的培養皿中，加入含1體積％或10體積％胎牛血清的完全培養基，蓋上蓋子，封口膜封口，分別放置于20-25℃及37℃溫度控制器內;

(4)細胞增殖情況檢測

生長于微載體上的細胞，在20-25℃及37℃溫度控制器內放置24-240小時后，取出搖勻，取100-1000微升細胞懸液，加入1-15體積％的CCK-8，25-37℃孵育1-4小時，取上清液于酶標板中，使用酶標儀在450-550納米波長下檢測上清液的OD值，OD值反應細胞的増殖。此時細胞不増殖，細胞處于休眠狀態，但仍有活性；

將含1％胎牛血清的培養基換成含10％胎牛血清的完全培養基，將溫度控制器升溫至37℃繼續培養24-240小時，取100-1000微升細胞懸液用上述CCK-8方法檢測細胞增殖情況，此時細胞已開始増殖，且與一直放置于37℃培養的對照組細胞沒有顯著差異。

2.根據權利要求1所述的溫度控制細胞培養方法，其特征在于，所述的微載體為球形，直徑在60-87微米。

3.根據權利要求1所述的溫度控制細胞培養方法，其特征在于，所述的所述的CCK-8是一種用于測定細胞増殖或毒性實驗中活細胞數目的高靈敏度的比色檢測法，其顏色變化與細胞數量成正比。

4.根據權利要求1所述的溫度控制細胞培養方法，其特征在于，所述的微載體由纖維素、粘多糖、膠原、聚苯乙烯、硅、丙烯酰胺中的一種或幾種制成。

5.根據權利要求1所述的溫度控制細胞培養方法，其特征在于，所述的磷酸鹽緩沖液DPBS由1-8克/升的氯化鈉、0.1-0.2克/升的氯化鉀、1-2克/升的磷酸氫二鈉、0.1-0.2克/升的磷酸二氫鉀制成。

6.根據權利要求1所述的溫度控制細胞培養方法，其特征在于，所述的腫瘤細胞為小鼠黑色素瘤細胞B16細胞、腎上皮細胞293細胞、人肺癌細胞H1299。

7.根據權利要求1所述的溫度控制細胞培養方法，其特征在于，所述的原代培養細胞為人皮膚成纖維細胞ESF細胞、小鼠胚胎成纖維細胞3T3-L1細胞。