[發明專利]檢測核酸突變的固相載體、試劑盒和方法

有效

• 申請號: 201210320467.5
• 申請日: 2012-09-03
• 公開（公告）號: CN102899399A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 盛司潼
• 申請（專利權）人: 深圳市華因康高通量生物技術研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地說，涉及檢測核酸突變的固相載體、試劑盒和方法。

背景技術

錯配識別蛋白（mismatch?binding?protein，MutS）是錯配修復系統行使修復功能的第一個蛋白，能夠識別并結合全部八種堿基錯配，還能識別結合1至4個核苷酸插入或缺失形成的loop環結構引起的錯配。

利用MutS的上述特殊功能，近年來己有一些研究探索MutS在檢測和富集突變以及檢測SNP方面的應用。其中，Rober?Wanger等提出了一種利用固定化的MutS檢測突變的方法，大致包括以下步驟：1）將含有MutS溶于反應緩沖液中，所述反應緩沖液為pH7.6，含有5mM氯化鎂，0.1mM二硫蘇糖醇，0.01mMEDTA的Tris-HCl溶液；2）將預濕的硝酸纖維膜置于48孔板中，加入含有MutS的反應緩沖液，每孔含有的MutS?500ng，室溫反應20min；3）然后加入3%?BSA，200μL/孔，封閉1h，洗去封閉液；4）將待測DNA溶于含有3%?BSA的反應緩沖液中，并加至經步驟3）處理后的48孔板中，0.05μg/μL-0.5μg/μL，20μL，室溫反應30min；5）用100μL反應緩沖液沖洗5次；6）加入含0.05μg/mL的鏈霉親和素-辣根過氧化物酶（Streptavidin-HRP），含BSA的反應緩沖液，100μL/孔，室溫反應20min；7）用100μL反應緩沖液沖洗5次；8）將硝酸纖維膜從48孔板中移出，用反應緩沖液沖洗，吸干，然后浸入化學發光試劑（ECL?development?solution,?Amersham）中反應1min，吸干后用X射線拍圖。

上述基于MutS檢測突變的方法中檢測步驟繁瑣，檢測效率不高，且無法直接排除檢測結果中的假陰性結果，準確率不高。如果要排除檢測結果中的假陰性實驗結果，需要對同一樣品進行重復檢測，這就必然進一步降低檢測效率，需要更多的待測樣品，而且這種重復檢測也僅僅能排除假陰性中因檢測步驟中的失誤引起的假陰性結果，而對于實驗材料，如固定有MutS的固相載體上固定的MutS單位密度過低而引起的假陰性結果無能為力。上述方法中披露了一種固定有MutS的固相載體，在具體的檢測應用中，該固定有MutS的固相載體檢測步驟繁瑣，檢測效率不高，且至少需要兩個固定有MutS的固相載體才能排除檢測結果中的部分假陰性結果。基于上述方法披露的固定有MutS的固相載體形成的試劑盒同樣存在上述問題。

因此需要一種新的檢測核酸突變的固相載體、試劑盒和方法，該固相載體、試劑盒在實際應用中能夠減少檢測步驟，提高檢測效率，排除檢測結果中的假陰性結果，提高檢測結果的準確率；該檢測核酸突變的方法能夠減少檢測步驟，提高檢測效率，排除檢測結果中的假陰性結果，提高檢測結果的準確率。

發明內容

本發明的目的在于提供一種新的檢測核酸突變的固相載體、試劑盒和方法，旨在解決現有技術檢測步驟繁瑣、檢測效率不高、檢測結果準確率低的問題。

一種檢測核酸突變的固相載體，所述固相載體表面固定有MutS；所述MutS含有報告基團；所述報告基團用于指示固相載體上MutS的數量。

其中，所述報告基團可為熒光標記基團或無熒光標記基團。

其中，所述無熒光標記基團優選為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素、親和素或鏈霉親和素。

上述任一種方案中，所述固相載體表面為適于包被蛋白的材料。

優選的，所述材料包括天然纖維素、被修飾的纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯、葡萄聚糖、尼龍、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、橡膠、金屬、金屬氧化物、玻片、硅片和陶瓷中的至少一種。

一種檢測核酸突變的試劑盒，包括檢測核酸突變的固相載體；所述固相載體表面固定有MutS；所述MutS含有報告基團；所述報告基團用于指示固相載體上MutS的數量。

其中，所述固相載體可采用本發明的檢測核酸突變的固相載體中的任一種。

其中，所述試劑盒還可包括標準品；所述標準品包括陽性標準品和陰性標準品；所述陽性標準品為含有堿基錯配或由1至4個核苷酸缺失或插入引起的錯配的雙鏈核苷酸分子；所述陰性標準品為完全互補的雙鏈核苷酸分子。

其中，所述試劑盒還可包括用于擴增特定區域的特異性引物。

上述任一種方案中，所述報告基團為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素、親和素或鏈霉親和素；所述試劑盒還包括顯色試劑；所述顯色試劑，用于與所述報告基團反應進而指示固相載體上MutS的數量。