[發明專利]一種棉花葉片蛋白質提取方法

無效

• 申請號: 201210319381.0
• 申請日: 2012-08-31
• 公開（公告）號: CN103665121A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 曲延英;陳全家;郭忠軍;孫國清
• 申請（專利權）人: 新疆農業大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C07K1/30
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 屈靜

技術領域

本發明涉及生物化學領域，尤其涉及一種棉花葉片蛋白質提取方法。

背景技術

棉花是世界上最重要的天然纖維作物,也是重要的油料作物；同時棉花也是世界性的重要的經濟作物，在國民經濟中占有重要的地位。棉花能制成各種規格的紡織物，這些紡織物具有穿著舒適，堅牢耐磨，能洗滌并在高溫下熨燙等特點。因此，棉花具有巨大的應用價值和開發潛力。

棉花作為一種重要的經濟和油料作物，在其進行大量的分子標記和QTL等研究后，對它開展蛋白質組研究就顯得十分迫切，也更為可行。但棉花中含有大量的色素、酚、醌等一些次生代謝產物，嚴重影響所提蛋白的純度，從而影響棉花蛋白質領域的研究，以及影響棉花產業的發展。因此，在提取蛋白質時應盡可能的除去這些物質的干擾，對解決棉花產業發展中遇到的技術問題具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種棉花葉片蛋白質提取方法，該方法提取的棉花葉片蛋白純度高，適合后續研究工作的開展，利于促進棉花產業發展。

一種棉花葉片蛋白質提取方法，包括以下步驟：

1）取棉花葉片，用液氮研磨；

2）經液氮研磨的葉片粉末轉入離心管中，并加入預冷的三氯乙酸提取液，混合均勻，放在－20℃冰箱中兩小時以上，每半小時震蕩一次；

3）離心管離心，棄上清，留沉淀，向沉淀中加入-20℃預冷丙酮溶液，混合均勻，于-20℃靜置2～4h；

4）離心管離心，棄上清，留沉淀，洗滌沉淀，并保留沉淀；

5）沉淀抽真空，揮發丙酮，得到蛋白質干粉；

6）取干燥的蛋白粉末，加入蛋白裂解液，35℃的水浴中裂解1h，離心，取上清，所述上清為棉花葉片蛋白溶解液。

所述三氯乙酸提取液的配方為：10%TCA，0.07%-0.1%DTT，0.5％β-巰基乙醇，1mmol/L?PMSF，溶劑為丙酮。

所述丙酮溶液含有0.07%-0.1%DTT和1mmol/L?PMSF。

所述蛋白裂解液的配方為：7mol/L尿素,2mol/L硫脲,4%CHAPS,80mmol/L?DTT,1mmol/L?PMSF，0.3%載體兩性電解質。

用液氮研磨葉片時加入PVPP和石英砂。

所述三氯乙酸提取液的用量是每0.4克葉片加入1.8mL預冷三氯乙酸提取液。

步驟4）所述沉淀重復洗滌3次或3次以上，或過夜洗滌，至接近白色。

所述蛋白裂解液的用量是每毫克干燥蛋白干粉加入蛋白裂解液20μl。

本發明所述棉花葉片蛋白質提取方法提取的蛋白質穩定,重復性好，且蛋白質純度較高,電泳圖譜顯示幾乎沒有橫條紋和拖尾等紋理現象,清晰，圓潤。

附圖說明

圖1不同提取方法對棉花葉片蛋白質2-DE圖譜的影響，A：酚法，B：TCA/丙酮法，C：改良的TCA/丙酮法；

圖2不同上樣量對棉花葉片蛋白質2-DE圖譜的影響(IPGpH4-7，18cm）；

圖3不同上樣量對棉花葉片蛋白質2-DE圖譜的影響(IPGpH4-7，24cm）。

具體實施方式

以下結合具體實施例對本發明的技術路線做進一步詳細說明。

本發明用到的材料：

植物材料：棉花品種“KK1543”，由新疆農業大學農學院作物遺傳實驗室提供。

實施例1棉花葉片獲取

選取籽粒飽滿且脫絨干凈的棉花種子處理后放入三角瓶里，浸種24小時，待種子露白后轉入放有兩層濾紙的發芽盒中，并保持發芽盒濕潤，待長出兩片子葉后，選取長勢健壯，均一的棉苗轉入1/2Hoagland培養液中，人工氣候室水培。培養條件為溫度為28/25C(白天/晚上)，光強為12000lx以上光照350～400，每天光照10小時，相對濕度為60～80%。每隔4d換一次培養液,并注意清洗根部和盆子等處的青苔，培養半個月后取其葉片，用純水，去離子水依次清洗干凈，用濾紙吸干水后，于液氮中速凍后置于-80℃超低溫冰箱保存，待用。

本實施例所用棉花為KK1543。

實施例2棉花葉片蛋白提取