[發明專利]酶切法制備寡聚透明質酸鹽的方法及所得寡聚透明質酸鹽和其應用

有效

• 申請號: 201210317032.5
• 申請日: 2012-08-31
• 公開（公告）號: CN102876748A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 郭學平;石艷麗;馮寧;王冠鳳;李海娜;喬莉蘋;王海英;欒貽宏;劉愛華
• 申請（專利權）人: 華熙福瑞達生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04;C12N9/88;C08B37/08;C12R1/07
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

1.一種酶切法制備寡聚透明質酸鹽的方法，其特征是：以芽孢桿菌（Bacillus?sp.）A50?CGMCC?NO.5744發酵培養得到的芽孢桿菌透明質酸酶對透明質酸或其鹽進行降解。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征是：包括以下步驟：

①配制透明質酸或其鹽溶液：向純化水中加入分子量大于10kDa的透明質酸或其鹽，配制成質量體積濃度為1~30%的溶液；?

②酶解：調節步驟①中溶液的溫度為20~48℃、pH為4~9，然后向其中加入芽孢桿菌透明質酸酶，將透明質酸或其鹽酶解至所需分子量，得酶解液；

③滅活：將酶解液在50~90℃下保持10~60min，對芽孢桿菌透明質酸酶進行滅活；

④過濾：向滅活后的酶解液中加入易溶性無機鹽，攪拌至完全溶解，然后用孔徑為0.45μm的濾膜過濾，得濾液，每100mL酶解液中加入0.1~10g的易溶性無機鹽；?

⑤沉淀：向步驟④的濾液中加入濾液體積3~20倍的醇或酮，混合均勻，得到寡聚透明質酸鹽沉淀；?

⑥脫水干燥：將步驟⑤中的寡聚透明質酸鹽沉淀分離出來，用有機溶劑脫水，然后真空干燥，得寡聚透明質酸鹽。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征是：每1kg透明質酸或其鹽配制成的溶液中加入2×10⁷~5×10⁷IU的芽孢桿菌透明質酸酶。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征是：所述芽孢桿菌透明質酸酶的制備方法包括以下步驟：

（1）將芽孢桿菌（Bacillus?sp.）A50?CGMCC?NO.?5744菌種進行斜面培養，得斜面菌種；

（2）取斜面菌種接種到已滅菌的種子培養基中，在25~40℃、100~200rpm的條件下培養10~24h，得種子液；

（3）將種子液接種到已滅菌的發酵培養基中，在25~40℃、100~300rpm的條件下培養12~24h，得發酵液；

（4）離心分離發酵液，取上清液，將上清液用硫酸銨分級沉淀出芽孢桿菌透明質酸酶；

（5）將步驟（4）沉淀出來的透明質酸酶溶于磷酸鹽緩沖液中，超濾除去小分子雜質，得純化的芽孢桿菌透明質酸酶；

對芽孢桿菌進行培養時，每100mL斜面培養基中含有以下成分：蛋白胨0.2~2.0g，酵母粉0.2~2.0g，K₂HPO₄·3H₂O?0.05~0.15g，MgSO₄·7H₂O?0.05~0.15g，葡萄糖0.5~1.5g，瓊脂粉2.0g，pH調至6.0~8.0；

每100mL種子培養基中含有以下成分：蛋白胨0.2~2.0g，酵母粉0.2~2.0g，K₂HPO₄·3H₂O?0.05~0.15g，MgSO₄·7H₂O?0.05~0.15g，葡萄糖0.5~1.5g，pH調至6.0~8.0；

每100mL發酵培養基中含有以下成分：蛋白胨0.2~2.0g，酵母粉0.2~2.0g，K₂HPO₄·3H₂O?0.05~0.15g，MgSO₄·7H₂O?0.05~0.15g，葡萄糖0.5~1.5g，Tween80?0.05mL，pH調至6.0~8.0。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征是：發酵液中芽孢桿菌透明質酸酶的酶活為1×10⁵~3×10⁵IU/mL，純化后芽孢桿菌透明質酸酶的比活為8×10⁶~1.5×10⁷IU/mg。

6.根據權利要求2所述的方法，其特征是：步驟①中，透明質酸鹽為透明質酸的鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽或鋅鹽；步驟②中，采用酸或堿調節pH至4~9，所述酸為鹽酸、冰乙酸、硫酸或磷酸，所述堿為氫氧化鈉或氫氧化鉀；步驟④中，所述易溶性無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋅鹽或鎂鹽；步驟⑤中，所述醇或酮為乙醇、丙酮、甲醇、丙醇或異丙醇；步驟⑥中，脫水所用的有機溶劑為酮或醇。