[發(fā)明專利]酶切法制備寡聚透明質(zhì)酸鹽的方法及所得寡聚透明質(zhì)酸鹽和其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210317032.5
• 申請(qǐng)日: 2012-08-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102876748A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭學(xué)平;石艷麗;馮寧;王冠鳳;李海娜;喬莉蘋(píng);王海英;欒貽宏;劉愛(ài)華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號(hào): C12P19/04
• 分類號(hào): C12P19/04;C12N9/88;C08B37/08;C12R1/07
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 李桂存

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶切法制備寡聚透明質(zhì)酸鹽的工藝過(guò)程，特別是涉及應(yīng)用芽孢桿菌來(lái)源的透明質(zhì)酸酶降解透明質(zhì)酸或其鹽制備寡聚透明質(zhì)酸鹽的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

透明質(zhì)酸(hyaluronic?acid，HA)是一種酸性黏多糖，由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸雙糖重復(fù)單位通過(guò)β-(1→4)糖苷鍵和β-(1→3)糖苷鍵構(gòu)成的無(wú)分支高分子糖胺聚糖，存在于動(dòng)物組織細(xì)胞間質(zhì)和某些細(xì)菌的莢膜中。透明質(zhì)酸廣泛用于醫(yī)藥、化妝品、食品等領(lǐng)域，分子量一般為10⁵~10⁷Da（道爾頓）。寡聚透明質(zhì)酸是指分子量小于10kDa的透明質(zhì)酸。研究表明，分子量對(duì)透明質(zhì)酸的活性有很大影響，不同分子量的透明質(zhì)酸甚至表現(xiàn)出截然相反的活性（郭學(xué)平等，低分子量及寡聚玻璃酸，中國(guó)生化藥物雜志，2003，24（3）：148-150）。

目前，透明質(zhì)酸降解的方法主要有物理降解、化學(xué)降解、生物降解三大類，物理降解法很難將透明質(zhì)酸降至10kDa以下，化學(xué)降解法和酶法可以制備寡聚透明質(zhì)酸，但化學(xué)降解法制備寡聚透明質(zhì)酸，需要較劇烈的反應(yīng)條件（如較高的酸堿濃度等）才能達(dá)到最大程度的降解。此時(shí)，不但糖鏈上的糖苷鍵斷裂，而且單糖（葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖）殘基的結(jié)構(gòu)也遭到破壞，如乙酰基被水解掉，單糖六元環(huán)斷裂等，對(duì)制得的寡聚透明質(zhì)酸的生物活性產(chǎn)生一定影響（郭學(xué)平等，低分子量及寡聚玻璃酸，中國(guó)生化藥物雜志，2003，24（3）：148-150）。化學(xué)降解法制備的寡聚透明質(zhì)酸還容易發(fā)生褐變（專利申請(qǐng)?zhí)?01110008110.9），生產(chǎn)過(guò)程會(huì)污染環(huán)境。而酶解法降解透明質(zhì)酸時(shí)，只斷裂單糖分子間的糖苷鍵，不會(huì)對(duì)其他結(jié)構(gòu)造成破壞，而且酶解法反應(yīng)條件溫和，不用強(qiáng)酸強(qiáng)堿，制備的寡聚透明質(zhì)酸不會(huì)發(fā)生褐變，不會(huì)造成環(huán)境污染，因此酶解法最適合制備寡聚透明質(zhì)酸。

降解透明質(zhì)酸所用的酶主要是透明質(zhì)酸酶，根據(jù)作用機(jī)制的不同，可以分為3類：（1）內(nèi)切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶，為水解酶，作用于β-1,4糖苷鍵，終產(chǎn)物主要為四糖，也可作用于軟骨素或硫酸軟骨素，并有轉(zhuǎn)糖苷酶活性。哺乳動(dòng)物來(lái)源的以及動(dòng)物毒液來(lái)源的屬于此類。（2）水蛭、十二指腸蟲(chóng)來(lái)源的透明質(zhì)酸酶，為內(nèi)切-β-葡糖苷酸酶，作用于β-1,3?糖苷鍵，也是水解酶，主要降解產(chǎn)物是四糖，特異性降解透明質(zhì)酸；（3）細(xì)菌透明質(zhì)酸酶，也稱為透明質(zhì)酸裂解酶（hyaluronate?lyase），作用于β-1,4糖苷鍵，通過(guò)β-消去機(jī)制得到4,5-不飽和雙糖（Kreil,?G,?Hyaluronidases--a?group?of?neglected?enzymes,?Protein?Sci,?1995,?4(9):?1666-1669）。

目前工業(yè)生產(chǎn)寡聚透明質(zhì)酸或其鹽的方法是化學(xué)降解法，由于含透明質(zhì)酸酶的動(dòng)物組織來(lái)源有限，有文獻(xiàn)報(bào)道的微生物來(lái)源透明質(zhì)酸酶發(fā)酵液?jiǎn)挝幻富钶^低，不可能大規(guī)模制備透明質(zhì)酸酶，也就不可能用酶法大規(guī)模生產(chǎn)寡聚透明質(zhì)酸或其鹽。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種酶切法大規(guī)模生產(chǎn)寡聚透明質(zhì)酸鹽的方法，本發(fā)明采用芽孢桿菌發(fā)酵得到的透明質(zhì)酸酶對(duì)高分子量透明質(zhì)酸或其鹽進(jìn)行降解，酶活高、條件溫和、操作簡(jiǎn)單、無(wú)環(huán)境污染。?

針對(duì)現(xiàn)今生物降解透明質(zhì)酸或其鹽所需降解酶活性低、來(lái)源有限、成本高的缺點(diǎn)，發(fā)明人從空氣中分離得到了一種產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的芽孢桿菌（Bacillus?sp.）A50，該菌種已經(jīng)在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC）進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為CGMCC?NO.?5744，保藏時(shí)間為2012年2月8日。

該芽孢桿菌（Bacillus?sp.）A50?CGMCC?NO.?5744的獲取過(guò)程為：將裝有富集培養(yǎng)基的平皿打開(kāi)蓋，放置于空氣中，收集空氣中沉降菌，約1h后，蓋上蓋，置于25~40℃培養(yǎng)箱中有氧培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后，將分離得到的單菌落接種于篩選培養(yǎng)基中，25~40℃，150rpm，有氧培養(yǎng)12~16h，采用中國(guó)藥典方法測(cè)定透明質(zhì)酸酶活力，選擇酶活力最高的菌種作為本發(fā)明的菌種，菌種酶活力可達(dá)10⁵IU/mL。

上述所采用的各培養(yǎng)基組成如下：