[發(fā)明專(zhuān)利]一種酶法制備L-二氫乳清酸的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210316992.X
• 申請(qǐng)日: 2012-08-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102787147A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-11-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹飛;黃榮醒;武紅麗;周佳棟;張煜;姚琴
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12P17/12
• 分類(lèi)號(hào): C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀(jì)昌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種酶法制備L-二氫乳清酸（1）的方法。

背景技術(shù)

L-二氫乳清酸，結(jié)構(gòu)式如下：

又名二氫-L-乳清酸L-4,5-二氫乳清酸；L-2,6-二氧六氫-4-嘧啶羧酸；L-六氫-2,6-二氧-4-嘧啶羧酸，是生物合成嘧啶類(lèi)核苷酸堿基如胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、羥甲基胞嘧啶的重要前體，也是合成抗腫瘤類(lèi)藥物合成的重要中間體。

目前，報(bào)道的L-二氫乳清酸制備方法主要有提取法、化學(xué)合成法。Miller等采用N^α-羧乙氧基天冬酰胺為原料，在乙醇鈉為催化劑的作用下，環(huán)合成為二氫乳清酸鈉鹽，鹽酸中和后結(jié)晶獲得二氫乳清酸，該方法根據(jù)使用原料不同可以獲得L、D、DL-二氫乳清酸，但該方法所需原料N^α-羧乙氧基天冬酰胺復(fù)雜，需要多步反應(yīng)制備獲得，反應(yīng)中使用的乙醇鈉也不易獲取（US?2,753,347）；U·米爾伯特等公開(kāi)了利用一種通過(guò)在陰離子交換材料，在堿水混合物中、約1.1MPa至約40MPa壓力下進(jìn)行層析得到L-二氫乳清酸的方法。該方法可以用來(lái)研究N-4（三氟甲基苯基）-5-甲基異噁唑-4-甲酰胺、N-4（三氟甲基苯基）-2-氰基-3-羥基丁烯酰胺及類(lèi)似化合物的體內(nèi)和體外活性（ZL98812046.1）。

二氫乳清酸酶(DHOase，EC?3.5.2.3)屬于環(huán)酰胺水解酶類(lèi)，能夠催化L-二氫乳清酸（L-DHO）水解生成N-氨基甲酰L-天冬氨酸（L-CA)，是嘧啶核苷酸從頭生物合成中的第三步關(guān)鍵酶。該酶活性中心處含兩個(gè)金屬鋅離子，當(dāng)二氫乳清酸結(jié)合在活性中心，其羰基上的氧原子被連接在β位的金屬鋅離子上，羰基被極化；活性中心處羥基親核攻擊，二氫乳清酸，形成一個(gè)連接兩金屬離子、二氫乳清酸以及酶的活性基團(tuán)的四面體中間物；進(jìn)一步使酰胺鍵斷裂導(dǎo)致四面體復(fù)合物的解體形成氨甲酰天冬氨酸。由于該酶處于嘧啶核苷酸生物合成途徑中的關(guān)鍵步驟，因此，以該酶為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)二氫乳清酸的抑制劑在在抗癌和抗瘧疾藥物的篩選中具有重要的用途；同時(shí)，Schroeder等利用其水解作用，催化水解開(kāi)環(huán)心血管藥物右丙亞胺獲取活性中間體。

雖然，目前二氫乳清酸酶的研究主要集中在水解反應(yīng)上，但在生物體內(nèi)，該酶催化過(guò)程是可逆的。即在堿性條件下，有利于水解反應(yīng)進(jìn)行，而調(diào)整pH為酸性條件時(shí)，則可實(shí)現(xiàn)N-氨基甲酰L-天冬氨酸到L-二氫乳清酸方向轉(zhuǎn)化。目前尚無(wú)利用二氫乳清酸酶逆向催化環(huán)合活性制備L-二氫乳清酸的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種酶法制備L-二氫乳清酸的方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種酶法制備L-二氫乳清酸的方法，包括下列步驟：

（1）L-天冬氨酸及其鹽制備N(xiāo)-氨甲酰-L-天冬氨酸。

以氰酸鹽和L-天冬氨酸及其鹽為原料，氰酸鹽與天冬氨酸的摩爾比為1~1.4:1，在堿性條件下進(jìn)行反應(yīng)，形成N-氨甲酰-L-天冬氨酸（3）。

其中，所述的L-天冬氨酸及其鹽為L(zhǎng)-天冬氨酸、L-天冬氨酸的鈉、鉀鹽中的任意一種。所述的氰酸鹽為氰酸鈉或氰酸鉀。所述的堿性條件下反應(yīng)條件為pH8.5～10.0、60~80℃、攪拌反應(yīng)1~3h，調(diào)堿所適用的堿可以是氫氧化鈉或是氫氧化鉀。

（2）N-氨甲酰-L-天冬氨酸經(jīng)二氫乳清酸酶催化環(huán)合制備L-二氫乳清酸。

以二氫乳清酸酶或含有二氫乳清酸酶的濕菌體為催化劑，在弱酸性條件下，催化環(huán)合N-氨甲酰-L-天冬氨酸（3）制備L-二氫乳清酸（1）。

其中，所述的菌體為含有二氫乳清酸酶的大腸桿菌K-12（Escherichia?coli?K-12，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)CICC20091)；所述的二氫乳清酸酶為含有二氫乳清酸酶基因pET-22b(+)-DHO-his質(zhì)粒的重組菌株E.coli?Rosetta(DE3)所表達(dá)、純化的二氫乳清酸酶。所述的弱酸性條件為pH2.0~4.0，酶或濕菌體與N-氨甲酰-L-天冬氨酸的重量比為1:1~80。催化水解反應(yīng)溫度為35~40℃，反應(yīng)時(shí)間10~15分鐘。

（3）將所得L-二氫乳清酸溶液分離，濃縮，結(jié)晶。

取酶反應(yīng)后的反應(yīng)液，加入三氯乙酸后使酶失活，離心除去蛋白或菌體，然后減壓蒸發(fā)結(jié)晶，無(wú)水乙醇重結(jié)晶，得L-二氫乳清酸晶體。

有益效果：