[發(fā)明專利]一種DNA Marker的制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210316670.5
• 申請(qǐng)日: 2012-08-31
• 公開（公告）號(hào): CN103667264A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉忱;高潔;張京;安娜;程倩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 沙船(天津)生物科技發(fā)展有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12N15/10;C12N15/70;C12N15/66
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• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種DNA?Marker的制備方法，其特征在于：在制備過程中采用DNA序列為SEQ?ID?NO.1和DNA序列為SEQ?ID?NO.2的兩種質(zhì)粒中的一種和兩種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA?Marker的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)在制備過程中采用DNA序列為SEQ?ID?NO.1和DNA序列為SEQ?ID?NO.2的兩種質(zhì)粒；

(2)將步驟(1)所述兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌后擴(kuò)增質(zhì)粒；

(3)分離質(zhì)粒并采用單酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶完全酶切獲得DNA?Marker所需片段，并將兩種質(zhì)粒完全酶切的產(chǎn)物按照2∶1的濃度比例混合，即獲得DNA?Marker。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA?Marker的制備方法，其特征在于：所述步驟(2)中宿主菌為大腸桿菌。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA?Marker的制備方法，其特征在于：所述步驟(3)中限制性內(nèi)切酶為：DNA序列為SEQ?ID?NO.1的質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶為Xmn?I，DNA序列為SEQ?ID?NO.2的質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶BamH?I。

5.一種用于DNA?Marker制備的質(zhì)粒，其特征在于：所述質(zhì)粒的DNA序列為SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2。

6.一種如權(quán)利要求5所述的用于DNA?Marker制備的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)根據(jù)目標(biāo)DNA?Marker的片段組成設(shè)計(jì)目標(biāo)質(zhì)粒，設(shè)計(jì)的目標(biāo)質(zhì)粒滿足下列要求：含有組成目標(biāo)DNA?Marker的各大小不同的DNA片段，各大小不同的DNA?Marker片段在所述質(zhì)粒中的拷貝數(shù)為一個(gè)以上，且各DNA?Marker片段之間含有同樣的單酶切位點(diǎn)；

(2)制備組成DNA?Marker的各個(gè)條帶的DNA?Marker前體片段，在每個(gè)DNA?Marker片段兩端加上一個(gè)不同于單酶切位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)，且同一片段的兩端酶切位點(diǎn)不可相同，后一片段的5’端酶切位點(diǎn)與前一片段的3’端酶切位點(diǎn)相同；

(3)將DNA?Marker片段依次進(jìn)行連接后采用第一片段的上游引物和最后一個(gè)片段的下游引物進(jìn)行PCR，從而得到所需要的大片段，在大片段中含有所述單酶切位點(diǎn)個(gè)數(shù)為最終得到片段的個(gè)數(shù)；

(4)在第一個(gè)質(zhì)粒構(gòu)建中單酶切位點(diǎn)在骨架載體中存在一個(gè)，第二個(gè)質(zhì)粒構(gòu)建中單酶切位點(diǎn)不存在于骨架載體中；

(5)選擇高拷貝數(shù)質(zhì)粒作為骨架載體，將體外連接好的片段與骨架載體進(jìn)行連接，形成可以用于DNA?Marker制備的質(zhì)粒。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于DNA?Marker制備的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟(3)具體步驟為：

分別以步驟(2)獲得的各DNA?Marker前體片段為起點(diǎn)，反復(fù)利用PCR的方式獲得含有各DNA?Marker前體片段的片段，直至各DNA?Marker前體片段連成一條大片段，然后將此片段連接入步驟(5)的骨架載體中，形成可以用于DNA?Marker制備的質(zhì)粒。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于DNA?Marker制備的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于：所述各片段兩端酶切位點(diǎn)及單酶切位點(diǎn)選自II型限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于DNA?Marker制備的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于：所述單酶切位點(diǎn)選自Xmn?I、BamH?I、Hind?III或EcoR?I。

10.根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的用于DNAMarker制備的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于：步驟(1)設(shè)計(jì)的目標(biāo)質(zhì)粒中，所述單酶切位點(diǎn)僅存在于各DNA?Marker片段之間，不存在于各DNA?Marker片段內(nèi)部，且質(zhì)粒中每?jī)蓚€(gè)相鄰的所述單酶切位點(diǎn)之間的距離均對(duì)應(yīng)等于目標(biāo)DNA?Marker中某一DNA片段的大小；

各DNA?Marker片段5’端和3’端帶有不同于所述單酶切位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)，同一片段的兩端的酶切位點(diǎn)不相同，且后一片段的5’端酶切位點(diǎn)與前一片段的3’端酶切位點(diǎn)相同。