[發明專利]一種DNA Marker的制備方法

無效

• 申請號: 201210316670.5
• 申請日: 2012-08-31
• 公開（公告）號: CN103667264A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 劉忱;高潔;張京;安娜;程倩
• 申請（專利權）人: 沙船(天津)生物科技發展有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12N15/70;C12N15/66
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技術領域

本發明屬于分子生物學與基因工程領域，涉及DNA?Marker和質粒，尤其是一種DNA?Marker的制備方法及兩種質粒和質粒的構建方法。?

背景技術

基因工程(genetic?engineering)又稱基因拼接技術和DNA重組技術，是以分子遺傳學為理論基礎，以分子生物學和微生物學的現代方法為手段，將不同來源的基因按預先設計的藍圖，在體外分子水平上對DNA進行切割、連接、轉化等一系列操作的過程，構建雜種DNA分子。基因工程是在分子生物學和分子遺傳學的基礎上綜合發展起來，誕生于20世紀70年代的一門嶄新的生物科學技術。盡管該技術是一門年輕的技術，但其在生命科學、生物醫學等領域的研究和應用中起到了非常巨大的作用。基因工程技術為基因的結構和功能的研究提供了有力的手段。?

在DNA的體外操作中，涉及到DNA分子的擴增、純化、切割、連接等許多過程，其中，最基礎而且應用非常廣泛的一項操作是DNA擴增和電泳。DNA擴增是指通過PCR(聚合酶鏈式反應)技術強大的擴增能力，在DNA聚合酶的作用下，根據特定的模板設計特定的引物擴增出不同大小的DNA片段。DNA電泳是指利用DNA在中性緩沖液中帶負電的性質，在一定的電場作用下，在特定的支持介質中(比如瓊脂糖凝膠)，不同大小的DNA片段由于帶有的電荷量以及空間位阻等的不同而在支持介質中具有不同的泳動速度從而得以分離的過程。DNA擴增和電泳是基因工程中最基本的技術。?

在凝膠電泳中，在一定的范圍內，具有相同構型的DNA在相同的凝膠濃度和電場強度下，其遷移率與DNA分子的大小(通常也就是DNA片段的長度)呈線性關系。因此，可以用一組分子量(長度)已知的DNA片段混合物來指示未知DNA分子的大小。這種由一組分子量已知的，電泳后按其分子量大小和遷移率的不同可以在凝膠上形成一個DNA片段分布梯度，從而可以指示電泳過程中未知DNA樣品的分子量的DNA片段混合物就成為DNA分子量標準，簡稱DNA?Marker。DNA?Marker的應用非常廣泛，是分子生物學實驗室的常用試劑。盡管實現DNA?Marker的原理非常簡單，但要制作低成本高質量的DNA?Marker還是有相當的難度。目前，許多生物公司也為此開發了多種針對不同應用的，具有不同分子量范圍的DNA?Marker產品。?

在DNA?Marker的制備上，目前主要有兩種方法：酶切法和PCR法。?

酶切法分為以天然來源的基因組DNA的限制性酶切和基于人工構建載體的限制性酶切。天然來源的基因組DNA酶切是指分離某種來源固定、背景信息清晰的基因組DNA分子，用?一種或幾種限制性內切酶進行消化。從而產生一系列DNA片段組合。用該方法生產的最經典的DNA?Marker是Lambda?DNA/Hind?III?Marker，Lambda噬菌體基因組DNA經過內切酶Hind?III消化后，產生125bp至23130bp大小的8條條帶。用這種方法生產DNA?Marker制作方便，在DNA來源方便的情況下，成本也比較低。但其缺點也是顯而易見的：1、條帶距離不均勻，由于來自天然的基因組，DNA分子上的酶切位點的位置也是天然的，是不可控的，因此DNA?Marker中有的兩個條帶之間相距很遠，不能清晰地指示該區域內的未知DNA分子量情況，有的兩個條帶之間距離很近，難以清晰地分開；2、基于同樣的原因，條帶的分子量未能是整數；3、條帶亮度嚴重不均一，由于對應片段在基因組中的拷貝數不可控，分子量大的條帶的亮度與分子量較小的條帶的亮度相差很遠，以Lambda?DNA/Hind?III?Marker為例，最大的條帶23130bp與最小的條帶125bp在亮度上要相差上百倍，電泳過程中往往導致大條帶為實現良好分離而小條帶已經嚴重擴散導致亮度很低甚至不可見。?

PCR法是根據特定的模板設計特定的引物擴增出一系列不同大小的DNA片段，通過純化、定量和組合即形成了DNA?Marker。該方法的優點是操作簡單、制作方便，各條帶的大小控制方便，不同大小的條帶可以靈活的組合成不同的DNA?Marker。但其成本較高，長片段擴增困難或效率不高，條帶不夠銳利，條帶之間的亮度難以完全一致，重復性差，穩定性不高，不易長時期保存，且保存環境在-20度，不能保存在室溫條件下，不便于使用。?